Aktualności

Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Używana wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, wyrenderujemy stronę bez stylów i JavaScriptu.
Komórki rakowe rozwinęły różne mechanizmy, aby przezwyciężyć stres komórkowy i kontynuować postęp.Kinaza białkowa R (PKR) i jej aktywator białkowy (PACT) są początkowymi reakcjami, które monitorują różne sygnały stresu prowadzące do zahamowania proliferacji komórek i apoptozy.Jednak regulacja szlaku PACT-PKR w komórkach nowotworowych pozostaje w dużej mierze nieznana.Tutaj odkryliśmy, że długi niekodujący RNA (lncRNA) antysensowny RNA 1 syntetazy aspartylowej tRNA (DARS-AS1) jest bezpośrednio zaangażowany w hamowanie szlaku PACT-PKR i promuje proliferację komórek rakowych.Stosując na dużą skalę funkcjonalne badania przesiewowe CRISPRi 971 związane z rakiem lncRNA, odkryliśmy, że DARS-AS1 wiązał się ze znacznie zwiększoną proliferacją komórek rakowych.Dlatego też nokaut DARS-AS1 hamuje proliferację komórek i promuje apoptozę komórek rakowych w różnych liniach komórek rakowych in vitro oraz znacząco ogranicza wzrost guza in vivo.Mechanicznie DARS-AS1 wiąże się bezpośrednio z domeną aktywacji PACT i zapobiega oddziaływaniu PACT-PKR, zmniejszając w ten sposób aktywację PKR, fosforylację eIF2α i hamując apoptotyczną śmierć komórek.Klinicznie DARS-AS1 jest szeroko wyrażany w wielu nowotworach, a nadekspresja tego lncRNA wskazuje na złe rokowanie.Badanie to wyjaśnia specyficzną dla raka regulację szlaku PACT-PKR przez lncRNA DARS-AS1 i stanowi kolejny cel dla prognozowania i leczenia raka.
Zdolność przystosowania się do stresu jest ważną cechą przeżycia i proliferacji komórek rakowych.Gwałtowna proliferacja i metaboliczne cechy charakterystyczne raka osiągają szczyt w trudnych mikrośrodowiskach — niedobór składników odżywczych, niedotlenienie i niskie pH — które mogą wyzwalać szlaki sygnałowe śmierci komórki.W nowotworach często obserwuje się rozregulowanie genów wrażliwych na stres, takich jak p535, białka szoku cieplnego 6, 7, KRAS8, 9 i HIF-110, 11, 12, 13, co blokuje apoptozę i sprzyja przeżyciu.
Kinaza białkowa R (PKR) jest ważnym czujnikiem stresu i kinazą podjednostkową eukariotycznego czynnika inicjacji 2α (eIF2α), regulatora translacji, który łączy stres komórkowy ze śmiercią komórki.PKR został pierwotnie zidentyfikowany jako białko przeciwwirusowe przez wykrycie obcego dwuniciowego RNA (dsRNA).Po aktywacji PKR fosforyluje eIF2α, hamując syntezę białek wirusowych i komórkowych14,15,16.PACT (białko aktywujące PKR) zostało zidentyfikowane jako pierwsze białko aktywujące PKR pod nieobecność dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Poprzez bezpośrednią interakcję z PKR, PACT przenosi różne stresy (głód surowicy, leczenie nadtlenkiem lub arseninem) na PKR i dalsze szlaki sygnałowe.Oprócz fosforylacji eIF2α, aktywacja PKR za pośrednictwem PACT wyzwala różne zdarzenia związane z reakcją na stres, w tym zmieniony status redoks poprzez szlak PI3K/Akt24, ulepszone sprawdzanie uszkodzeń DNA poprzez p5325,26 i NF-κB27,28 reguluje transkrypcję, 29. Biorąc pod uwagę ich kluczową rolę w odpowiedzi na stres, proliferacji, apoptozie i innych kluczowych procesach komórkowych, PKR i PACT są obiecującymi celami terapeutycznymi w przypadku wielu chorób, zwłaszcza raka30,31,32,33.Jednak pomimo tego plejotropowego funkcjonalnego i biologicznego znaczenia, regulacja aktywności PACT/PKR w komórkach nowotworowych pozostaje nieuchwytna.
lncRNA to transkrypty większe niż 200 nukleotydów bez potencjału kodowania białek.Odkąd nowatorskie projekty sekwencjonowania całego genomu zidentyfikowały tysiące lncRNA,35,36 włożono wiele wysiłku w wyjaśnienie ich funkcji biologicznych.Coraz więcej badań wykazało, że lncRNA są zaangażowane w wiele procesów biologicznych37, w tym w regulację inaktywacji chromosomu X38,39, imprinting40, transkrypcję41,42, translację43, a nawet wzrost raka44,45,46,47.Badania te wykazały, że wiele lncRNA jest zaangażowanych w szlak PACT/PKR.Jedno z takich badań wykazało, że lncRNA ASPACT hamuje transkrypcję PACT i zwiększa retencję jądrową mRNA PACT.Inne badania wykazały, że lncRNA nc886 wiąże się z PKR i hamuje jego fosforylację49,50.Jak dotąd nie doniesiono o regulacji przez lncRNA aktywacji PKR za pośrednictwem PACT.
Antysensowny RNA 1 syntetazy aspartylo-tRNA (DARS-AS1) został zidentyfikowany jako onkogenny lncRNA51,52,53,54.Wykazano, że poprzez regulację miP-194-5p53, miP-12952 i miP-532-3p51, DARS-AS1 sprzyja wzrostowi odpowiednio jasnokomórkowego raka nerki, raka tarczycy i niedrobnokomórkowego raka płuc.Tong i współpracownicy odkryli również, że DARS-AS1 sprzyja progresji szpiczaka poprzez utrzymanie stabilności motywu wiążącego RNA białka 39 (RBM39).Jednak nie przeprowadzono żadnych badań dotyczących tego, czy ten lncRNA bierze udział w regulacji aktywacji PACT-PKR i odpowiedzi na stres komórek nowotworowych.
Tutaj przeprowadziliśmy na dużą skalę badanie przesiewowe utraty funkcji za pomocą systemu CRISPRi i ustaliliśmy, że lncRNA DARS-AS1 promuje proliferację kilku typów komórek rakowych.Ponadto zidentyfikowaliśmy główny mechanizm: DARS-AS1 wiąże się bezpośrednio z PACT, hamuje wiązanie PACT i PKR, zapobiega fosforylacji eIF2α, niższego substratu PKR, i ostatecznie hamuje apoptotyczną śmierć komórek.Podsumowując, nasza praca ujawnia lncRNA DARS-AS1 jako regulator szlaku PACT-PKR i potencjalny cel leczenia raka i prognozowania.
Zakrojone na szeroką skalę badania profilowania genomowego pozwoliły zidentyfikować setki lncRNA związanych z rakiem.Jednak ich funkcja pozostaje w dużej mierze nieznana56.Aby zidentyfikować obiecujących kandydatów na lncRNA zaangażowanych w progresję raka, przeprowadziliśmy badanie przesiewowe utraty funkcji pod kątem zmniejszonej proliferacji w linii komórkowej raka jelita grubego SW620 przy użyciu systemu CRISPRi (ryc. 1a).Unikalną cechą linii komórek raka okrężnicy SW480 i SW620 jest to, że pochodzą one z guzów pierwotnych i wtórnych u jednego pacjenta.Stanowi to cenne porównanie do badania zmian genetycznych w progresji zaawansowanego raka okrężnicy.Dlatego przeanalizowaliśmy transkryptomy linii komórkowych raka jelita grubego (SW480 i SW620) za pomocą sekwencjonowania RNA i zebraliśmy niektóre potencjalne funkcjonalne lncRNA z opublikowanej literatury.W oparciu o te wyniki zaprojektowaliśmy połączoną bibliotekę sgRNA zawierającą 7355 oligonukleotydów sgRNA ukierunkowanych na 971 lncRNA związanych z rakiem i 500 nieukierunkowanych oligonukleotydów sgRNA jako kontrolę ujemną (dane uzupełniające 1).
Schematyczne przedstawienie badań przesiewowych za pomocą systemu CRISPRi.b Wzbogacenie sgRNA po badaniu przesiewowym.Pozioma linia przerywana przedstawia log2 (krotność zmiany) = ±0,58.Pionowa przerywana linia wskazuje wartość p = 0,05.Czarne kropki reprezentują sgRNA niedocelowe (oznaczone jako NC).Czerwone kropki to sgRNA celujące w DARS-AS1.Niebieskie kropki to sgRNA celujące w LINC00205, wcześniej opisany onkogenny lncRNA.krotność zmiany = (znormalizowany odczyt, dzień 17)/(znormalizowany odczyt, dzień 0).c knockdown sgRNA DARS-AS1 zahamował wzrost komórek.Słupki błędów reprezentują ± odchylenie standardowe trzech eksperymentów.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 dwustronny test t-Studenta.d Ekspresja DARS-AS1 w nowotworach (zestaw danych TCGA).em Ekspresja DARS-AS1 w sparowanych próbkach prawidłowych i nowotworowych od pacjentów odpowiednio z BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP i COAD (zestaw danych TCGA).wartości p uzyskano za pomocą sparowanego dwustronnego testu t-Studenta.
Po skonstruowaniu plazmidu i zapakowaniu lentiwirusa transdukowaliśmy linię komórek raka jelita grubego dCas9-SW620 powyższą biblioteką w czterech niezależnych eksperymentach z infekcją.Wielokrotność infekcji (MOI) dla tych infekcji wynosiła 0,1–0,3, co wskazuje, że każda komórka może być transfekowana tylko jednym sgRNA.Po 18 dniach hodowli in vitro profil wzbogacenia docelowych sgRNA zmniejszył się lub wzrósł po badaniu przesiewowym, podczas gdy liczba nieukierunkowanych oligonukleotydów kontrolnych pozostała względnie niezmieniona w porównaniu z profilem wstępnego badania przesiewowego, co wskazuje, że nasz cel ma wysoce specyficzny biblioteka.Ryż.1b i tabela uzupełniająca 1). LINC00205, o którym wcześniej donoszono, że promuje progresję raka płuc i raka wątroby58,59,60, został przebadany (log2 (zmiana krotności) <-0,58, wartość p <0,05), potwierdzając wiarygodność tego badania przesiewowego (ryc. 1b). LINC00205, o którym wcześniej donoszono, że promuje progresję raka płuc i raka wątroby58,59,60, został przebadany (log2 (zmiana krotności) <-0,58, wartość p <0,05), potwierdzając wiarygodność tego badania przesiewowego (ryc. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, wcześniej zgłaszany jako promujący progresję raka płuc i raka wątroby58,59,60, został wykluczony (log2 (krotność zmiany) <-0,58, wartość p <0,05), potwierdzając wiarygodność tego badania przesiewowego (ryc. .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0,58，p 值<0,05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0,58，p 值<0,05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, o którym wcześniej donoszono, że sprzyja progresji raka płuc i wątroby58,59,60, został wykluczony (log2 (krotność zmiany) <-0,58, wartość p <0,05), potwierdzając solidność tego badania przesiewowego (ryc. 1b).
Spośród wszystkich testowanych lncRNA przebadano również DARS-AS1, przy czym trzy pokrewne oligonukleotydy sgRNA zostały znacznie zredukowane po 18 dniach hodowli, co sugeruje, że knockdown tego lncRNA skutkował zmniejszoną proliferacją raka (ryc. 1b).Wynik ten został dodatkowo potwierdzony przez analizę MTS w komórkach raka jelita grubego wykazującą, że tempo wzrostu komórek DARS-AS1 knockdown było tylko o połowę mniejsze w porównaniu z komórkami kontrolnymi (ryc. 1c) i było zgodne z wcześniejszymi doniesieniami o kilku innych typach raka.: jasnokomórkowy rak nerki, rak tarczycy i niedrobnokomórkowy rak płuc51,52,53,55.Jednak jego funkcja i mechanizmy molekularne w raku jelita grubego pozostają niezbadane.Dlatego wybraliśmy ten lncRNA do dalszych badań.
Aby zbadać ekspresję DARS-AS1 u pacjentów, kompleksowo przeanalizowaliśmy 10 327 próbek guzów z projektu Cancer Genome Atlas (TCGA).Nasze wyniki pokazują, że DARS-AS1 jest szeroko wyrażany i znacznie podwyższony w zdrowych komórkach w różnych nowotworach, w tym gruczolakoraku okrężnicy (COAD), raku jasnokomórkowym nerki (KIRC) i raku nerkowo-brodawkowatym (KIRP)..Bardzo niewiele (ryc. 1d i uzupełniający ryc. 1a, b). Analiza sparowanych próbek zdrowych/guzowych dodatkowo potwierdziła znacznie wyższą ekspresję DARS-AS1 w guzach raka urotelialnego pęcherza moczowego (BLCA), raka jasnokomórkowego nerki (KIRC), gruczolakoraka prostaty (PRAD), raka płaskonabłonkowego płuc (LUSC) , rak endometrium trzonu macicy (UCEC), gruczolakorak płuc (LUAD), rak wątrobowokomórkowy (LIHC), rak nerkowo-brodawkowaty (KIRP) i gruczolakorak okrężnicy (COAD) (wartość p < 0,05) (ryc. 1e-m) . Analiza sparowanych próbek zdrowych/guzowych dodatkowo potwierdziła znacznie wyższą ekspresję DARS-AS1 w guzach raka urotelialnego pęcherza moczowego (BLCA), raka jasnokomórkowego nerki (KIRC), gruczolakoraka prostaty (PRAD), raka płaskonabłonkowego płuc (LUSC) , rak endometrium trzonu macicy (UCEC), gruczolakorak płuc (LUAD), rak wątrobowokomórkowy (LIHC), rak nerkowo-brodawkowaty (KIRP) i gruczolakorak okrężnicy (COAD) (wartość p < 0,05) (ryc. 1e-m) .Analiza sparowanych próbek zdrowych/guzowych potwierdziła również znacząco wyższą ekspresję DARS-AS1 w raku urotelialnym pęcherza moczowego (BLCA), raku jasnokomórkowym nerek i nerkowokomórkowym (KIRC), gruczolakoraku prostaty (PRAD), raku płaskonabłonkowym płuc (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , rak trzonu macicy (UCEC), gruczolakorak płuc (LUAD), rak wątrobowokomórkowy wątroby (LIHC), rak brodawkowaty nerki (KIRP) i gruczolakorak okrężnicy (COAD) (wartość p < 0,05) (ryc. 1e–m) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)肿瘤中的显着更高表达，子宫体子宫内膜癌（UCEC），肺腺癌（LUAD），肝肝细胞癌（LIHC），肾肾乳头状细胞癌（KIRP）和结肠腺癌（COAD）（p值<0,05）（图1e-m）.配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 表达 ， 内膜 癌 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Analiza próbek par zdrowych/guzowych dodatkowo potwierdziła rolę DARS-AS1 w raku urotelialnym pęcherza moczowego (BLCA), raku jasnokomórkowym nerki (KIRC), gruczolakoraku prostaty (PRAD) i raku płaskonabłonkowym płuc (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ekspresja w raku trzonu macicy (UCEC), gruczolakoraku płuc (LUAD), raku wątrobowokomórkowym (LIHC), raku nerkowo-brodawkowatym (KIRP) i gruczolakoraku okrężnicy (COAD) (wartość p <0,05) (Figura 1e-m).Podsumowując, wyniki te wskazują, że DARS-AS1 jest szeroko i wysoko wyrażany w różnych nowotworach.
Ponieważ DARS-AS1 i DARS (gen kodujący nić antysensowną) mają ten sam promotor i znajdują się obok siebie, zaprojektowaliśmy shRNA specjalnie do knockdown DARS-AS1, ale nie DARS (ryc. uzupełniająca 2a, b i tabela uzupełniająca 2 ) .Oprócz SW620 wykorzystaliśmy również trzy inne linie komórkowe z wysoką ekspresją DARS-AS1 do badania skuteczności i funkcji knockdown shRNA (tabela uzupełniająca 3).Nasze wyniki wskazują, że wszystkie trzy opracowane shRNA osiągnęły co najmniej 80% skuteczności knockdown DARS-AS1 z niewielkim wpływem na ilość mRNA DARS (ryc. uzupełniający 2c–f).Ponadto odkryliśmy, że knockdown DARS-AS1 za pomocą tych shRNA znacząco hamował wzrost komórek w liniach komórkowych raka jelita grubego SW620 (49,7%) i HCT116 (27,7%), linii komórkowej raka piersi MBA-MD-231 (53,4%).) i linii komórkowej wątrobiaka HepG2 (redukcja 92,7%), a także ich zdolność do tworzenia niezakotwiczonych sfer (średnia redukcja ~50,8%, 44,6%, 40,7% i 75,7% na linię komórkową) (ryc. 2a,b).W SW620 wyniki testu tworzenia kolonii potwierdziły ponadto, że shRNA DARS-AS1 znacząco hamuje proliferację komórek ze średnim spadkiem około 69,6% (Fig. 2c).
Wpływ kontrolnego shRNA i DARS-AS1 shRNA na proliferację komórek (a) i tworzenie sferoid (b) w komórkach SW620, HCT116, MBA-MD-231 i HepG2.c Wpływ kontrolnego shRNA i DARS-AS1 shRNA na tworzenie kolonii w komórkach SW620.Proliferacja komórek (d), tworzenie sferoidy (e) i tworzenie kolonii (f) komórek SW620 z nadekspresją DARS-AS1.Przedstawione dane to średnia ± odchylenie standardowe z trzech eksperymentów.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 oraz *** p ≤ 0,001 w dwustronnym teście t-Studenta.
Aby uzupełnić badania nad utratą funkcji, stworzyliśmy następnie komórki SW620 z nadekspresją DARS-AS1 (rysunek uzupełniający 2g).Nadekspresja DARS-AS1 znacząco zwiększyła wzrost komórek (1,8-krotnie), tworzenie niezakotwiczonych sferoid (1,4-krotnie) i tworzenie kolonii (3,3-krotnie) w komórkach SW620 (ryc. 2d-f).Potwierdziliśmy ten wynik przy użyciu innej linii komórkowej wyrażającej DARS-AS1, A549.Ta zwiększona proliferacja komórek spowodowana nadekspresją DARS-AS1 była dalej obserwowana w komórkach A549 (ryc. uzupełniająca 2h, i i tabela uzupełniająca 3).Podsumowując, te badania zysków i strat pokazują, że DARS-AS1 promuje proliferację komórek rakowych in vitro.
Aby zbadać leżący u podstaw mechanizm, za pomocą którego DARS-AS1 reguluje proliferację komórek, przeprowadziliśmy analizę RNA pull-down, aby zidentyfikować jego potencjalnych partnerów wiążących białka.Wyniki RT-qPCR wykazały, że około 86,2% DARS-AS1 znajduje się w cytoplazmie komórek SW620 (rysunek uzupełniający 3a).Transkrybowany in vitro biotynylowany DARS-AS1 lub pseudoRNA następnie inkubowano z lizatami komórkowymi SW620, a następnie rozdzielano SDS-PAGE.Późniejsze barwienie srebrem wykazało, że wyraźny prążek (~38 kDa) był znacząco wzbogacony w próbkach DARS-AS1 pull, ale nie w próbkach pozorowanego RNA lub kulek (ryc. 3a).Ten prążek zidentyfikowano jako białko aktywujące PKR (PACT) metodą spektrometrii mas (MS) i dodatkowo potwierdzono przez immunoblotting w liniach komórkowych SW620, HCT116 i HepG2 (Fig. 3a, b).Wzbogacenie DARS i pokrewnych białek PACT – PKR i TRBP – zbadano również za pomocą analizy RNA metodą Western blotting (WB).Wyniki wskazują, że nie znaleziono bezpośredniej interakcji między RNA DARS-AS1 a tymi trzema białkami (ryc. uzupełniający 3b).Specyficzne oddziaływanie między DARS-AS1 i PACT zostało dodatkowo potwierdzone przez analizę immunoprecypitacji RNA (RIP), która wykazała, że ​​DARS-AS1 był znacząco wzbogacony w przeciwciała anty-PACT, ale nie w inne kontrolne RNA (Figura 3c).Aby określić, czy DARS-AS1 oddziałuje bezpośrednio z PACT pod nieobecność jakichkolwiek innych składników komórkowych, przeprowadzono test interferometrii biowarstwy (BLI) in vitro przy użyciu oczyszczonego PACT.Znakowane biotyną DARS-AS1 lub pozorowane RNA unieruchomiono na biosensorach streptawidyny (SA), a następnie inkubowano w buforze kinetycznym zawierającym 1 µM PACT.Warto zauważyć, że PACT silnie wiązał się z DARS-AS1 (wartość KD ~26,9 nM), ale nie naśladował RNA (Figura 3d).Podsumowując, wyniki te wskazują na bezpośrednią interakcję i wysokie powinowactwo między DARS-AS1 i PACT.
Analiza RNA pull zidentyfikowała interakcję DARS-AS1 z PACT w komórkach SW620.Powyżej barwienie srebrem białek pokrewnych.Niższe immunobloty przeprowadzono z przeciwciałem anty-PACT.b Analizę pull-down RNA przeprowadzono w komórkach HCT116 (góra) i HepG2 (dół).Wzbogacenie PACT wykryto metodą immunoblottingu.Testy immunoprecypitacji cRNA (RIP) przeprowadzono w komórkach SW620 stosując wskazane przeciwciała.d Krzywe wiązania PACT z DARS-AS1 o pełnej długości lub kontrolnym RNA uzyskano za pomocą interferometrii warstwy biologicznej (BLI).RNA unieruchomiono na biosensorze streptawidyny.Do pomiaru asocjacji zastosowano 1 μM PACT.Test e-RNA pull przeprowadzono przy użyciu biotynylowanego DARS-AS1 o pełnej długości lub skróconego (góra).Immunoblot pokazujący otrzymany PACT (na dole).f Oczyszczony flagowany PACT inkubowano z biotynylowanym DARS-AS1 o pełnej długości lub skrócono (jak w e) do testu RIP in vitro.Wyekstrahowany RNA zweryfikowano metodą RT-qPCR.g Względne powinowactwo różnych fragmentów RNA do PACT uzyskano stosując interferometrię warstwy biologicznej.Do analizy użyto 100 nM RNA i 1 μM RAST.h Testy RIP in vitro przeprowadzono przy użyciu oczyszczonego nienaruszonego lub skróconego znakowanego PACT.Wyekstrahowany RNA zweryfikowano metodą RT-qPCR.i Tempo wzrostu komórek SW620 z nadekspresją DARS-AS1, PACT lub obu.j Nadekspresja pełnej długości lub skróconego DARS-AS1 w komórkach SW620 miała różny wpływ na wzrost komórek.k Apoptozę wykryto przez immunoblotting z przeciwciałem anty-PARP.l Knockout DARS-AS1 indukuje apoptozę komórek SW620, jak pokazano za pomocą cytometrii przepływowej.Przedstawione dane to średnia ± odchylenie standardowe z trzech eksperymentów. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 za pomocą dwustronnego testu t-Studenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 za pomocą dwustronnego testu t-Studenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 w dwustronnym teście t-Studenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 w dwustronnym teście t-Studenta.
Następnie wygenerowaliśmy trzy biotynylowane fragmenty RNA DARS-AS1 przez transkrypcję in vitro w celu zidentyfikowania regionu DARS-AS1 wymaganego do powiązania PACT (Figura 3e).Wyniki analizy RNA wykazały, że każdy fragment był w stanie oddziaływać z PACT, ale region 3′-końcowy (384–768 nukleotydów oznaczonych A3) wykazał więcej niż 1–384 nukleotydów oznaczonych A1) (ryc. 3e).Podobne wyniki zaobserwowano w teście RIP in vitro przy użyciu rekombinowanego PACT (Figura 3f).Zgodnie z tymi wynikami, eksperymenty wiązania unieruchomionych fragmentów RNA z PACT przy użyciu BLI wykazały również, że PACT ma wyższe powinowactwo do A3 (384–768 nt) (wartość KD około 94,6 nM), podczas gdy prawie nie ma powiązań z innymi obszarami.(rys. 3d).
Zbadaliśmy również powiązane regiony wiążące w PACT.PACT zawiera trzy domeny funkcjonalne, z których dwie są konserwatywnymi domenami wiążącymi dwuniciowy RNA (dsRBD), a trzecia domena (oznaczona jako D3) działa jako aktywator oddziaływań białkowych.Aby zbadać zdolność wiązania lncRNA każdej domeny, zmodyfikowaliśmy trzy mutacje, które usunęły każdą z trzech domen i przeprowadziliśmy test RIP in vitro.Nasze wyniki wykazały, że usunięcie trzeciej domeny (D3) PACT znacząco zmniejszyło jego interakcję z DARS-AS1 (o 0,11-krotnie w porównaniu z nienaruszonym PACT) w porównaniu z pozostałymi dwiema mutacjami (ryc. 3h), wykazano, że uwolnienie D3 wchodził w interakcję z DARS.-AC1.Podsumowując, wyniki te sugerują, że interakcja między DARS-AS1 i PACT może zachodzić głównie poprzez koniec 3' DARS-AS1 i domenę D3 PACT.
Zauważyliśmy, że DARS-AS1 nie miał wpływu na ekspresję PACT, a PACT nie miał wpływu na DARS-AS1 (rysunek uzupełniający 3c).Następnie zbadaliśmy wpływ knockdown PACT na wzrost komórek.W przeciwieństwie do DARS-AS1 względne komórki rosły 1,5–3 razy szybciej, gdy PACT został stłumiony (ryc. uzupełniający 3d).Wyniki testu tworzenia kolonii wskazywały, że komórki utworzyły 2-3-krotne kolonie po potraktowaniu shRNA PACT (rysunek uzupełniający 3e).Aby sprawdzić, czy DARS-AS1 reguluje proliferację komórek poprzez PACT, wygenerowaliśmy komórki SW620 z nadekspresją PACT, DARS-AS1 lub obu.Nadekspresja PACT wykazała znaczące zahamowanie proliferacji komórek (Figura 3i).Podczas gdy nadekspresja DARS-AS1 per se znacząco promowała proliferację komórek, nie było znaczącej różnicy w szybkości wzrostu komórek z nadekspresją DARS-AS1 i PACT.Wyniki te sugerują, że PACT może przeciwdziałać zwiększonej proliferacji spowodowanej nadekspresją DARS-AS1.
Ponieważ różne regiony DARS-AS1 mają różne zdolności wiązania PACT, zbadaliśmy ich względny wpływ na proliferację komórek poprzez różną nadekspresję fragmentów DARS-AS1.W porównaniu z pozostałymi dwoma fragmentami, DARS-AS1 był nadeksprymowany na końcu 3' (384-768 nt), głównym regionie związanym z PACT w DARS-AS1, który miał najwyższą zdolność do stymulowania proliferacji komórek (ryc. 3j).Wyniki te wskazują na dodatnią korelację między zdolnością wiązania a funkcją biologiczną DARS-AS1.
Doniesiono, że PACT jest białkiem proapoptotycznym19.Dlatego zbadaliśmy wpływ DARS-AS1 na apoptozę.Zgodnie z oczekiwaniami, knockdown DARS-AS1 znacząco zwiększył rozszczepianie PARP w komórkach SW620 i zwiększył udział komórek dodatnich pod względem aneksyny V w liniach komórkowych SW620, HCT116, HepG2 i MBA-MD-231 (Fig. 3k).3).3f–h), wskazując, że działanie antyapoptotyczne DARS-AS1 w komórkach nowotworowych jest przeciwne do indukującej apoptozę funkcji PACT.Podsumowując, wyniki te sugerują, że mechanizm funkcji onkogennej DARS-AS1 może wynikać z hamowania funkcji PACT.
Następnie zbadaliśmy funkcjonalne implikacje powiązania DARS-AS1-PACT.Istnieją doniesienia, że ​​PACT aktywuje PKR poprzez bezpośrednią interakcję, która następnie wzmaga fosforylację eIF2α, powodując delecję translacyjną i apoptozę17.Najpierw zbadaliśmy, czy DARS-AS1 wpływa na komórkową lokalizację PACT i PKR.Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna wykazała, że ​​PACT i PKR były silnie kolokalizowane w komórkach SW620 ze średnim współczynnikiem korelacji Pearsona 0,72.Tymczasem nadekspresja DARS-AS1 istotnie zmniejszyła kolokalizację PACT i PKR (średni współczynnik korelacji Pearsona 0,61) (ryc. 4a).Aby zbadać, czy DARS-AS1 może modulować oddziaływanie PACT-PKR, przeprowadziliśmy test koimmunoprecypitacji (co-IP) z przeciwciałem anty-PACT w lizatach komórkowych SW620.PKR był wysoce wzbogacony w anty-PACT w komórkach kontrolnych, podczas gdy odzysk PKR był znacznie zmniejszony w lizatach z komórek z nadekspresją DARS-AS1 (ryc. 4b).Oczyszczone znakowane PACT i PKR zastosowano do testów wiązania białek in vitro.W związku z tym te, które dostarczyły DARS-AS1, ale nie miały kontrolnego RNA, wykazywały tłumioną interakcję PACT-PKR (Figura 4c).Wszystkie wyniki wykazały, że DARS-AS1 zakłócił komunikację PACT i PKR.
Wspólną lokalizację PACT i PKR w komórkach kontrolnych lub komórkach z nadekspresją DARS-AS1 obserwowano przy użyciu współogniskowej mikroskopii fluorescencyjnej.Jądra wybarwiono DAPI.Wyniki statystyczne uzyskano z 16 fotografii.b Koimmunoprecypitacja (co-IP) przy użyciu przeciwciała anty-PACT w lizatach komórkowych kontrolnych komórek SW620 lub komórek z nadekspresją DARS-AS1.c Znakowany PACT, oczyszczony PKR i transkrybowany in vitro z DARS-AS1 lub próbnym RNA inkubowano do analizy wiązania białka in vitro.Do immunoprecypitacji zastosowano przeciwciała anty-flagowe.d Immunobloty ze wskazanymi przeciwciałami przeprowadzono w komórkach SW620 i HCT116 transfekowanych kontrolnym shRNA lub DARS-AS1-shRNA, a następnie głodzono surowicą.e Poziomy ekspresji DARS-AS1 zmieniały wrażliwość komórek na tapsigarginę.Komórki SW620 transfekowano shRNA DARS-AS1, plazmidem z nadekspresją DARS-AS1 lub plazmidem kontrolnym.Komórki traktowano tapsigarginą przez 48 godzin, a żywotność komórek określano przy użyciu odczynnika MTS.f Transkrybowany in vitro DARS-AS1 lub obojętne RNA i oczyszczony PACT zastosowano do testu aktywacji in vitro i wykrywania immunoblot.g Immunobloty z użyciem tych przeciwciał przeprowadzono na komórkach SW620-ctrl (po lewej) lub komórkach z nadekspresją mutantów PKR (po prawej).Komórki te następnie transfekowano kontrolnym shRNA lub DARS-AS1-shRNA, a następnie głodzono surowicą.h Cytometria przepływowa wykazała, że ​​inaktywacja zmutowanego PKR kompensowała apoptozę indukowaną przez DARS-AS1 w komórkach SW620.i Immunobloty ze wskazanymi przeciwciałami przeprowadzono w komórkach SW620 (po lewej) lub HCT116 (po prawej).Komórki transfekowane kontrolnym shRNA lub DARS-AS1 shRNA są pozbawione surowicy i uzupełnione 100 nM inhibitorem PKR C16 lub DMSO.Skala = 5 µm.Przedstawione dane to średnia ± odchylenie standardowe z trzech eksperymentów.* p ≤ 0,05 dwustronny test t-Studenta.
Ogólnie uważa się, że gdy PACT wejdzie w interakcję z PKR17, można zaindukować fosforylację PKR w Thr451.Nasze wyniki wskazują, że poziom fosforylacji PKR był znacząco podwyższony w komórkach DARS-AS1 knockdown po głodzie surowicy (ryc. 4d i uzupełniający ryc. 4a).W związku z tym stwierdziliśmy, że fosforylacja eIF2α, głównego substratu PKR, była również znacząco zwiększona przez shRNA DARS-AS1 (ryc. 4d i uzupełniająca ryc. 4a).Thapsigargin jest stresorem ER, który powoduje, że ER uwalnia Ca2+.Doniesiono, że leczenie tapsigarginą indukuje ekspresję i aktywację PACT, który dalej oddziałuje i aktywuje PKR, prowadząc do apoptozy poprzez zwiększenie fosforylacji eIF2α18,61.Tutaj użyliśmy tapsigarginy jako stymulatora szlaku PACT/PKR, aby zbadać, czy DARS-AS1 może pomóc komórkom przezwyciężyć stres poprzez hamowanie szlaku PACT/PKR.Zaobserwowaliśmy, że poziom ekspresji DARS-AS1 dodatnio koreluje z opornością komórek na tapsygarginę.Komórki SW620 z nadekspresją DARS-AS1 przeżywały lepiej, gdy były leczone tapsigarginą, podczas gdy komórki z knockdown DARS-AS1 stały się bardziej podatne (ryc. 4e).Zgodnie z tymi wynikami, nadekspresja DARS-AS1 zmniejszyła indukowaną przez tapsygarginę fosforylację PKR (rysunek uzupełniający 4b).W przeciwieństwie do tego, po traktowaniu tapsigarginą, PKR i eIF2α były fosforylowane w większym stopniu w komórkach knockdown DARS-AS1 w porównaniu z komórkami kontrolnymi (rysunek uzupełniający 4b).Co ciekawe, tapsigargina indukowała ekspresję DARS-AS1 w sposób zależny od dawki, co może wskazywać na antystresową funkcję DARS-AS1 (ryc. uzupełniający 4c).Ponadto przeprowadziliśmy testy aktywacji in vitro, aby potwierdzić te obserwacje.W skrócie, PKR oczyszczono z lizatów komórkowych przy użyciu przeciwciała anty-PKR, a następnie inkubowano z rekombinowanymi PACT i DARS-AS1 transkrybowanymi in vitro.Po reakcji enzymatycznej wykrywano fosfo-PKR stosując WB.Nasze wyniki wskazują, że fosforylacja PKR była znacząco hamowana przez DARS-AS1, ale nie przez kontrolny RNA (Figura 4f).Te wyniki in vitro i in vivo sugerują, że DARS-AS1 hamuje aktywację PKR za pośrednictwem PACT.Jednocześnie zaobserwowaliśmy również spadek odzysku PACT w obecności DARS-AS1 (ryc. 4f).Wynik ten jest zgodny z wynikami testu wiązania białka in vitro (Figura 4c) i ponownie ilustruje funkcję blokowania DARS-AS1 dla asocjacji PACT-PKR.
Ser246 i Ser287 w domenie D3 PACT są wymagane do aktywacji PKR pod wpływem stresu komórkowego.Podstawienie dwóch reszt seryny na alaninę dało zmutowany PACT (mutD), który aktywował PKR przy braku stresu, a podstawienie na alaninę (mutA) odwróciło protokół.Ponieważ wykazaliśmy znaczenie tej domeny w bezpośrednim związku z DARS-AS1, wytworzyliśmy te dwa mutanty PACT, aby sprawdzić, czy te reszty mogą również brać udział w interakcji z DARS-AS1.Co ciekawe, oba mutanty utraciły zdolność wiązania się z DARS-AS1 (rysunek uzupełniający 4d), co sugeruje, że pełna struktura białka PACT może być wymagana do skutecznej interakcji z DARS-AS1.
Ponadto, nasze wyniki sugerują również, że hamowanie proliferacji komórek indukowane przez DARS-AS1-shRNA można częściowo przywrócić przez nadekspresję dominującego negatywnego mutanta PACT (PACTmutA) lub dominującego negatywnego mutanta PKR (PKRmut) (ryc. uzupełniająca 4e.e).Nadekspresja dominujących negatywnych mutantów PKR zmniejszyła fosforylację PKR indukowaną przez knockdown DARS-AS1, jak również fosforylację eIF2α w komórkach pozbawionych surowicy (Fig. 4g).Co ważniejsze, proporcja komórek apoptotycznych indukowanych przez knockdown DARS-AS1 była również zmniejszona w komórkach z nadekspresją PKRmut (ryc. 4h i uzupełniająca ryc. 4g).Hamowanie aktywności kinazy PKR osłabia również funkcję DARS-AS1, ponieważ wyniki wykazały, że knockdown DARS-AS1 rzadko wyzwalał fosforylację PKR i eIF2α, gdy komórki były traktowane inhibitorem C16 specyficznym dla PKR (ryc. 4i i uzupełniająca ryc. 4h).).Podsumowując, nasze wyniki sugerują, że DARS-AS1 promuje proliferację komórek, przynajmniej częściowo, poprzez hamowanie aktywacji PKR, w której pośredniczy PACT.
Aby dalej zbadać rolę DARS-AS1 w onkogenezie, przeprowadziliśmy eksperymenty in vivo na mysim modelu heteroprzeszczepu. Wyniki pokazują, że knockdown DARS-AS1 dramatycznie zmniejszył wzrost guza u myszy (wartość p < 0,0001) (Fig. 5a). Wyniki pokazują, że knockdown DARS-AS1 dramatycznie zmniejszył wzrost guza u myszy (wartość p < 0,0001) (Fig. 5a). Raporty ogłoszone, что нокдаун DARS-AS1 otrzymał odpowiedź na pytanie, czy jest to możliwe (zgodnie z p <0,0001) (rys. 5a). Wyniki pokazują, że knockdown DARS-AS1 drastycznie zmniejsza wzrost guza u myszy (wartość p < 0,0001) (Figura 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a）。 Opublikowane raporty, то нокдаун DARS-AS1 знаительно снижает опухоли у мышей (знаение р <0,0001) (rys. 5a). Wyniki pokazały, że knockdown DARS-AS1 znacząco zmniejszył wzrost guza u myszy (wartość p < 0,0001) (Figura 5a).Tak więc w grupie knockdown DARS-AS1 nastąpił znaczny spadek średniej objętości guza o około 72,9% i średniej masy guza o około 87,8% (Figura 5b-d).Wyniki te silnie sugerują, że DARS-AS1 może znacząco promować wzrost guza in vivo.
Wpływ knockdown ad DARS-AS1 na onkogenezę jelita grubego u nagich myszy.Przedstawiono krzywe wzrostu (a), wielkość guza (b), masę (c) i obrazy guza (d).Słupki błędów reprezentują ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001 za pomocą dwustronnego testu t-Studenta. n = 10. ****p < 0,0001 za pomocą dwustronnego testu t-Studenta. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 dwustronny test t-Studenta.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 dwustronny test t-Studenta.e Kaplan-Meier przeanalizował korelację między poziomem ekspresji DARS-AS1 a całkowitym przeżyciem u pacjentów z UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM i LGG.Wysokie poziomy ekspresji DARS-AS1 u pacjentów znajdowały się w górnych 50%;niski poziom ekspresji DARS-AS1 u pacjentów mieścił się w dolnych 50%.wartości p określono za pomocą testu log-rank.f Proponowany model, w którym DARS-AS1 reguluje szlak PACT-PKR i wzrost guza.
Aby lepiej zrozumieć wpływ kliniczny DARS-AS1, zbadaliśmy korelację między jego ekspresją a przeżyciem pacjenta.Analizując zestaw danych TCGA, odkryliśmy, że wyższa ekspresja DARS-AS1 była powiązana z czerniakiem błony naczyniowej oka (UVM), chromofobią nerkową (KICH), rakiem brodawkowatym nerki (KIRP), międzybłoniakiem (MESO), multipleksem.Niższe przeżycie było istotnie związane z morfozą glejaka (GBM) i pacjentami z glejakiem mózgu o niskim stopniu złośliwości (LGG) (Figura 5e).Wyniki te sugerują, że DARS-AS1 może odgrywać ważną rolę w klinicznej progresji guza i może być potencjalnym biomarkerem predykcyjnym w wielu nowotworach.
W tym badaniu, stosując wielkoskalowe funkcjonalne badania przesiewowe CRISPRi, ustaliliśmy, że lncRNA DARS-AS1 pokonuje stres komórek rakowych poprzez regulację dwóch kluczowych reagujących na stres, PACT i PKR.Poprzez bezpośrednią interakcję z PACT, DARS-AS1 hamował aktywację PKR za pośrednictwem PACT, zapobiegając w ten sposób apoptotycznej śmierci komórek i promując proliferację komórek (ryc. 5f).Regulację w górę DARS-AS1 zaobserwowano w wielu typach raka, co sugeruje, że jego funkcja promowania przeżycia komórek rakowych w stresujących warunkach może mieć szerokie zastosowanie w wielu typach raka.
PACT został zidentyfikowany jako białko aktywujące PKR, a aktywacja PKR, w której pośredniczy PACT, odgrywa ważną rolę w odpowiedziach na stres poprzez regulację transkrypcji, translacji, apoptozy i innych ważnych procesów komórkowych62.Przez dziesięciolecia podejmowano próby zrozumienia specyficznej dla raka regulacji kaskady PACT-PKR.Tutaj nasze badanie ujawniło inny mechanizm regulacji PACT-PKR w komórkach nowotworowych poprzez komórkowy lncRNA DARS-AS1, który bezpośrednio wiąże się z PACT, blokuje interakcję PACT-PKR, hamuje aktywację PKR i fosforylację eIF2α, tym samym hamując wywołaną stresem apoptozę i stymulowanie ewentualnej proliferacji raka.komórki.To odkrycie rzuca światło na potencjalne cele lncRNA w prognozowaniu i leczeniu raka.
Nasze dane wykazały, że knockdown DARS-AS1 uwrażliwia komórki na głód surowicy ze znacznym wzrostem fosforylowanego PKR i eIF2α.Wyniki te sugerują, że DARS-AS1 promuje przeżycie komórek rakowych w trudnych warunkach poprzez hamowanie aktywności PACT/PKR.Kilka innych niekodujących RNA, takich jak ASPACT i nc886, jest również zaangażowanych w oś PACT/PKR poprzez regulację w dół mRNA PACT48 lub regulację autofosforylacji poprzez wiązanie z PKR49,50,64.Wśród nich DARS-AS1 działa jako zakłócacz stowarzyszenia PACT-PKR.Badanie to wzbogaca naszą wiedzę na temat regulacji osi PACT/PKR oraz roli lncRNA w odpowiedzi na stres.
PACT zawiera trzy odrębne domeny.Każda z pierwszych dwóch dsRBD jest wystarczająca do osiągnięcia wysokiego powinowactwa wiązania PACT do PKR, podczas gdy trzecia domena (D3) jest wymagana do aktywacji PKR in vitro i in vivo.Nasze badanie wykazało, że DARS-AS1 preferencyjnie oddziałuje z domeną D3 (ryc. 3h).Biorąc pod uwagę duży rozmiar lncRNA (768 nukleotydów), wiązanie DARS-AS1 z D3 może fizycznie hamować oddziaływanie między domeną PACT dsRBD i PKR, blokując w ten sposób powiązanie PACT i PKR.Mutacje punktowe PACT, które zastąpiły Ser246 i Ser287 w D3 alaniną lub asparaginianem, zakłóciły jego powinowactwo wiązania z DARS-AS1, wskazując na znaczenie ogólnych właściwości strukturalnych i elektrycznych D3 w ich związku.Dalsze szczegóły tego mechanizmu będą wymagane w przyszłości, z wykorzystaniem dokładniejszej analizy biochemicznej i analizy strukturalnej PACT o wysokiej rozdzielczości.
Wcześniejsze badania wykazały, że DARS-AS1 promuje proliferację komórek poprzez kilka mechanizmów51,52,53.W jednym przykładzie badacze zaobserwowali, że DARS-AS1 podwyższa poziom genu DARS kodującego białko antysensowne poprzez celowanie w miP-194-5p w komórkach raka nerki.Jednak w niniejszym badaniu knockdown DARS-AS1 miał niewielki wpływ na transkrypcję DARS w wielu typach raka, w tym przynajmniej raku jelita grubego, piersi i wątroby.Ponieważ lncRNA wykazują wzorce ekspresji specyficzne dla komórek i tkanek, mechanizmy funkcjonalne mogą nie być zachowane w różnych typach nowotworów, co może przyczyniać się do tej rozbieżności między naszymi obserwacjami a wcześniejszymi ocenami różnych nowotworów.Potrzebne są specjalne badania, aby wyjaśnić specyficzne mechanizmy różnych procesów fizjologicznych i patologicznych.
Analiza danych klinicznych wykazała, że ​​ekspresja DARS-AS1 w guzach jest odwrotnie skorelowana z przeżywalnością chorych na nowotwory, co podkreśla znaczenie osi DARS-AS1/PACT/PKR w rokowaniu nowotworów.Podsumowując, nasze badanie pokazuje, że DARS-AS1 jest regulatorem osi sygnalizacyjnej PACT/PKR, promuje proliferację komórek rakowych i hamuje apoptozę podczas reakcji na stres, co stanowi kolejny kierunek badań i jest przedmiotem zainteresowania przyszłych badań nad potencjalnymi terapiami .
Ludzkie linie komórkowe SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 i HEK293T uzyskano z National Cell Line Resource Infrastructure w Chinach.Wszystkie komórki utrzymywano w pożywce DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) uzupełnionej 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) i 1% penicyliną-streptomycyną (Thermo Fisher Scientific) w 37°C, 5% CO2.inkubator.
Anty-PACT, Abcam (ab31967);Anty-PKR, Abcam (ab184257);Anty-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anty-eIF2a, Abcam (A0764));anty-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);anty-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anty-β-tubulina, CST (2128);normalne mysie IgG, CST (5415S);normalne królicze IgG, CST (2729S).Przeciwciała rozcieńczono 1:1000 w PBST do Western blot i 1:100 do IP.
sgRNA zostały opracowane przy użyciu publicznie dostępnego narzędzia o nazwie CRISPR-ERA66.Użyliśmy domyślnych parametrów narzędzia do rozwoju sgRNA i algorytm obliczył miejsca wiązania sgRNA w regionie 3 kb.wyśrodkowany w TSS.Pule oligonukleotydów sgRNA zsyntetyzowano w CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) i sklonowano do humanizowanych plazmidów pgRNA (Addgene #44248).W sumie 12 µg połączonego humanizowanego plazmidu pgRNA, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) i 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) kotransfekowano do 5 x 106 HEK293T na 10 cm płytkach przy użyciu odczynnika do transfekcji DNAfect ogniwa ( CWBIO, Pekin, Chiny) zgodnie z instrukcją producenta.Supernatanty zawierające wirusy zebrano 48 i 72 godziny po transfekcji i przefiltrowano przez filtr 0,45 µm.Do badań przesiewowych komórki SW620 wyrażające białko fuzyjne dCas9/KRAB otrzymano przez transdukcję wirusa.Zmodyfikowane komórki SW620 infekowano biblioteką wirusów w czterech niezależnych eksperymentach infekcji przy MOI 0,1-0,3 i pobierano próbki 2 μg/ml puromycyny (Sigma, St. Louis, MO) przez 2 dni.Następnie komórki hodowano przez 18 dni in vitro przy minimalnym pokryciu biblioteki 500 komórek/sgRNA do przeszukiwania.
Genomowy DNA wyekstrahowano zgodnie z instrukcjami zestawu QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Niemcy; 51183).W sumie do zbudowania biblioteki użyto 100 μg genomowego DNA na powtórzenie biologiczne.Region sgRNA amplifikowano w dwóch rundach PCR i połączono z kodem kreskowym.
Produkty PCR oczyszczono stosując żel NucleoSpin® i zestaw do oczyszczania PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Niemcy; 740609.250) i oznaczono ilościowo przy użyciu zestawu do wykrywania dwuniciowego DNA Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Do pomiaru proliferacji komórek zastosowano test MTS.Komórki wysiano na 96-studzienkowych płytkach przy początkowej gęstości 2000 komórek/studzienkę.Względną liczbę komórek mierzono codziennie we wskazanym czasie przez łącznie 4-6 dni.Dla każdej studzienki 20 μl odczynnika MTS (Promega) rozcieńczono 100 μl DMEM, inkubowano z komórkami przez 4 hw 37°C, a następnie zmierzono OD490.
Zdolność do niezakotwiczonego wzrostu została odkryta poprzez analizę formowania się sfer.W skrócie, 2000 komórek transfekowanych shRNA DARS-AS1 lub kontrolnym shRNA hodowano w mikropłytkach o ultra niskim przyleganiu (Corning) ze zmianą pożywki co 4 dni.Sferoidy zliczono po 14 dniach.Do testu wzmocnienia stosowano 500 komórek transfekowanych plazmidem nadekspresji DARS-AS1 lub plazmidem kontrolnym, w przeciwnym razie metoda pozostała niezmieniona.
RNA transkrybowano przy użyciu polimerazy T7 RNA i biotyny-16-UTP (Roche 1138908910) zgodnie z instrukcjami Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Stosowane tutaj podkłady są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 4.
Kodujące białko regiony PACT lub PKR wklonowano do pET15b (Addgen #73619) i transformowano do BL21(DE3).Bakterie inkubowano przez noc w LB zaopatrzonym w ampicylinę, a następnie rozcieńczono 100-krotnie świeżym LB.Gdy OD600 pożywki osiągnęło 0,8, dodano 1 mM IPTG w celu indukcji ekspresji białka.Po całonocnej inkubacji z delikatnym wytrząsaniem (250 obr./min w 20°C), osad komórek zebrano przez odwirowanie (4000 obr./min, 10 min, 4°C).Ponownie zawiesić osad komórek w buforze do lizy (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) i inkubować na lodzie przez 30 min, następnie sonikować (15 min, 5 s wł./wył., na lodzie) i odwirować (13 000 obr./min)., 30 min, 4°C).Supernatant następnie ładowano na żywicę Ni-NTA (QIAGEN) 3 razy w 4°C, przemywano 4 razy buforem do płukania (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) i eluowano 3 razy, łącznie 10 ml buforu eluentu (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Oczyszczone białko oznaczono przy użyciu WB, a stężenie określono przy użyciu zestawu do oznaczania białek Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Testy RIP przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem, z modyfikacjami.W skrócie, 1x bufor RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, inhibitor rybonukleazy RNasin (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteaza) lizy cytostatyk 1 x 107 koktajl (Roche, 1 mM DTT) i wirować przy 13 000 obr./min przez 15 min w 4°C.Supernatant następnie inkubowano z kulkami magnetycznymi białka A+G (Millipore) sprzężonymi z 5 μg przeciwciała anty-PACT (Abeam) lub IgG (CST).Kulki przemywano 5 razy buforem 5x RIP, a następnie trawiono proteinazą K (NEB).RNA wyekstrahowano Trizolem i oznaczono metodą RT-qPCR.Podkłady przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 5.
Test RIP in vitro przeprowadzono zgodnie ze zmodyfikowanym standardowym protokołem testu RIP.Łącznie 5 pmoli RNA transkrybowanego in vitro rozcieńczono 1x buforem RIP i poddano hybrydyzacji przez inkubację w 65°C przez 5 minut, a następnie powolne schłodzenie do temperatury pokojowej.W sumie 5 pmoli nienaruszonych lub zmutowanych znakowanych flagowo białek PACT oczyszczono z E. coli.Inkubuj z renaturowanym RNA przez 2 godziny w 4°C i postępuj zgodnie z powyższą procedurą analizy RIP pod kątem IP anty-flag.
Do analizy wydłużania RNA, 1x107 komórek poddano lizie za pomocą buforu 1xRIP.Po odwirowaniu przy 13000 obr/min przez 15 min w 4°C, supernatant wstępnie potraktowano 30 µl streptawidyny magnetycznych kulek (Beckman) przez 2 hw 4°C.Oczyszczony lizat następnie dostarczano z drożdżowym tRNA i inkubowano z 40 pmoli renaturowanego RNA przez noc w 4°C, a następnie przez kolejne 2 godziny i dodano 20 μl nowych kulek magnetycznych streptawidyny zablokowanych BSA.Etap płukania składał się 4 razy z 5x buforem RIP i 4 razy z 1x buforem RIP.Odpowiednie białka eluowano biotynowym buforem do elucji (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotyna, PMSF) i rozdzielano na NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Po barwieniu srebrem (Beyotime Biotechnology) niektóre prążki wycięto i przeanalizowano metodą MS.
Przeprowadzono analizę Co-IP w celu przetestowania interakcji między PACT i PKR.Pokrótce, lizaty supernatantów przygotowano przez inkubację 1 x 107 zlizowanych komórek w buforze 1 x RIP, a następnie odwirowanie przy 13000 obr./min przez 15 minut w 4°C.Lizaty załadowano kulkami magnetycznymi z białkiem A + G, skoniugowano z 5 µg przeciwciała anty-PACT i delikatnie obracano przez noc w 4°C.Perełki przemyto 3 razy buforem 5xRIP, dwukrotnie buforem 1xRIP i eluowano buforem 1xSDS.Odzyskane białko analizowano na żelu SDS-PAGE i wykrywano przez WB.
Z E. coli oczyszczono 2 pmoli oflagowanego PACT i 1 pmola PKR.Rozcieńczyć w buforze 1x RIP i inkubować z 10 pmoli renaturowanego RNA przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.Następnie inkubowano je z anty-znakowanym przeciwciałem sprzężonym z białkiem A+G z magnetycznymi kulkami przez dodatkowe dwie godziny.Perełki następnie przemyto czterokrotnie buforem 1x RIP i wymyto buforem 1x SDS.Powstałe PACT i PKR zostały wykryte przez WB.