Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Używana wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, wyrenderujemy stronę bez stylów i JavaScriptu.
Skuteczne fotouczulacze są szczególnie ważne w powszechnym klinicznym zastosowaniu fototerapii.Jednak konwencjonalne fotosensybilizatory generalnie cierpią z powodu absorpcji przy krótkich długościach fali, niewystarczającej fotostabilności, niskiej wydajności kwantowej reaktywnych form tlenu (ROS) i wygaszania ROS wywołanego agregacją.Tutaj przedstawiamy supramolekularny fotosensybilizator bliskiej podczerwieni (NIR) (RuDA), w którym pośredniczy samoorganizacja kompleksów metaloorganicznych Ru(II)-aren w roztworze wodnym.RuDA może generować tlen singletowy (1O2) tylko w stanie zagregowanym i wykazuje oczywiste zachowanie generowania 1O2 wywołane agregacją ze względu na znaczny wzrost procesu krzyżowania między układem singletowo-trypletowym.Pod działaniem światła laserowego 808 nm, RuDA wykazuje wydajność kwantową 1O2 16,4% (zatwierdzona przez FDA zieleń indocyjaninowa: ΦΔ=0,2%) i wysoką wydajność konwersji fototermicznej 24,2% (komercyjne nanopręty ze złota) z doskonałą fotostabilnością.: 21,0%, złote nanoskorupy: 13,0%).Ponadto RuDA-NP o dobrej biokompatybilności mogą preferencyjnie gromadzić się w miejscach guza, powodując znaczną regresję guza podczas terapii fotodynamicznej z 95,2% zmniejszeniem objętości guza in vivo.Ta zwiększająca agregację terapia fotodynamiczna zapewnia strategię rozwoju fotouczulaczy o korzystnych właściwościach fotofizycznych i fotochemicznych.
W porównaniu z terapią konwencjonalną, terapia fotodynamiczna (PDT) jest atrakcyjną metodą leczenia raka ze względu na jej znaczące zalety, takie jak dokładna kontrola czasoprzestrzenna, nieinwazyjność, znikoma lekooporność i minimalizacja skutków ubocznych 1,2,3.Pod wpływem naświetlania fotosensybilizatory mogą zostać aktywowane, tworząc wysoce reaktywne formy tlenu (ROS), co prowadzi do apoptozy/martwicy lub odpowiedzi immunologicznej4,5. Jednak większość konwencjonalnych fotosensybilizatorów, takich jak chloryny, porfiryny i antrachinony, charakteryzuje się stosunkowo krótką absorpcją fal (częstotliwość <680 nm), co powoduje słabą penetrację światła ze względu na intensywną absorpcję cząsteczek biologicznych (np. hemoglobiny i melaniny) w widoczny region6,7. Jednak większość konwencjonalnych fotosensybilizatorów, takich jak chloryny, porfiryny i antrachinony, charakteryzuje się stosunkowo krótką absorpcją fal (częstotliwość <680 nm), co powoduje słabą penetrację światła ze względu na intensywną absorpcję cząsteczek biologicznych (np. hemoglobiny i melaniny) w widoczny region6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. Jednak większość powszechnych fotosensybilizatorów, takich jak chloryny, porfiryny i antrachinony, ma stosunkowo krótką absorpcję długości fali (<680 nm), co skutkuje słabą penetracją światła ze względu na intensywną absorpcję cząsteczek biologicznych (np. hemoglobiny i melaniny) do obszaru widzialnego6,7.然而，大多数传统的光敏剂，如二氢卟酚、卟啉和蒽醌，具有相对较短的波长吸收（频率<680 nm），因此由于对生物分子（如血红蛋白和黑色素）的强烈吸收， ja然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 频率 频率 <680 nm） 因此 由于 对 分子 （血红 蛋白 和 黑色素） 的 ， ， ， ， 吸收 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. Jednak większość tradycyjnych fotouczulaczy, takich jak chloryny, porfiryny i antrachinony, ma stosunkowo krótką absorpcję długości fali (częstotliwość <680 nm) ze względu na silną absorpcję biocząsteczek, takich jak hemoglobina i melanina, co powoduje słabą penetrację światła.Widoczny obszar 6.7.Dlatego fotosensybilizatory absorbujące bliską podczerwień (NIR), które są aktywowane w „oknie terapeutycznym” 700–900 nm, dobrze nadają się do fototerapii.Ponieważ światło bliskiej podczerwieni jest najmniej absorbowane przez tkanki biologiczne, może prowadzić do głębszej penetracji i mniej fotouszkodzeń8,9.
Niestety, istniejące fotosensybilizatory absorbujące NIR mają na ogół słabą fotostabilność, niską zdolność generowania tlenu singletowego (1O2) i wygaszanie 1O2 wywołane agregacją, co ogranicza ich zastosowanie kliniczne10,11.Chociaż poczyniono wielkie wysiłki w celu poprawy właściwości fotofizycznych i fotochemicznych konwencjonalnych fotosensybilizatorów, do tej pory kilka raportów donosiło, że fotosensybilizatory absorbujące NIR mogą rozwiązać wszystkie te problemy.Ponadto, kilka fotosensybilizatorów dało nadzieję na wydajne generowanie 1O212,13,14 przy napromieniowaniu światłem powyżej 800 nm, ponieważ energia fotonu gwałtownie spada w obszarze bliskiej podczerwieni.Trifenyloamina (TFA) jako donor elektronów i [1,2,5]tiadiazolo-[3,4-i]dipirydo[a,c]fenazyna (TDP) jako grupa akceptorów elektronów Barwniki typu donor-akceptor (DA) klasa barwników, absorbujących bliską podczerwień, które były szeroko badane pod kątem bioobrazowania w bliskiej podczerwieni II i terapii fototermicznej (PTT) ze względu na ich wąską przerwę energetyczną.Zatem barwniki typu DA mogą być stosowane do PDT ze wzbudzeniem w bliskiej podczerwieni, chociaż rzadko były badane jako fotosensybilizatory do PDT.
Powszechnie wiadomo, że wysoka skuteczność przejścia międzysystemowego (ISC) fotosensybilizatorów sprzyja tworzeniu się 1O2.Powszechną strategią postępu procesu ISC jest wzmocnienie sprzężenia spin-orbita (SOC) fotosensybilizatorów poprzez wprowadzenie ciężkich atomów lub specjalnych ugrupowań organicznych.Podejście to ma jednak pewne wady i ograniczenia19,20.Ostatnio samoorganizacja supramolekularna zapewniła oddolne inteligentne podejście do wytwarzania materiałów funkcjonalnych na poziomie molekularnym,21,22, z licznymi zaletami w fototerapii: (1) samoorganizujące się fotosensybilizatory mogą mieć potencjał tworzenia struktur wstęgowych.Podobny do struktur elektronicznych o gęstszym rozkładzie poziomów energii ze względu na nakładanie się orbit między blokami budulcowymi.Zatem dopasowanie energetyczne pomiędzy niższym stanem wzbudzonym singletowym (S1) i sąsiednim stanem wzbudzonym trypletowym (Tn) ulegnie poprawie, co jest korzystne dla procesu ISC 23, 24 .(2) Montaż supramolekularny zmniejszy relaksację niepromienistą w oparciu o mechanizm ograniczenia ruchu wewnątrzcząsteczkowego (RIM), który również promuje proces ISC 25, 26 .(3) Zespół supramolekularny może chronić wewnętrzne cząsteczki monomeru przed utlenianiem i degradacją, znacznie poprawiając w ten sposób fotostabilność fotosensybilizatora.Biorąc pod uwagę powyższe zalety, uważamy, że supramolekularne systemy fotosensybilizatorów mogą być obiecującą alternatywą dla przezwyciężenia wad PDT.
Kompleksy oparte na Ru(II) stanowią obiecującą platformę medyczną do potencjalnych zastosowań w diagnostyce i terapii chorób ze względu na ich unikalne i atrakcyjne właściwości biologiczne28,29,30,31,32,33,34.Ponadto obfitość stanów wzbudzonych i przestrajalne właściwości fotofizykochemiczne kompleksów opartych na Ru(II) zapewniają ogromne korzyści dla rozwoju fotosensybilizatorów opartych na Ru(II)35,36,37,38,39,40.Godnym uwagi przykładem jest kompleks polipirydylowy rutenu(II) TLD-1433, który jest obecnie w fazie II badań klinicznych jako fotouczulacz w leczeniu nieinwazyjnego raka pęcherza moczowego (NMIBC)41.Ponadto kompleksy metaloorganiczne rutenu(II)aren są szeroko stosowane jako środki chemioterapeutyczne w leczeniu raka ze względu na ich niską toksyczność i łatwość modyfikacji42,43,44,45.Właściwości jonowe kompleksów metaloorganicznych Ru(II)-aren mogą nie tylko poprawić słabą rozpuszczalność chromoforów DA w powszechnych rozpuszczalnikach, ale także poprawić montaż chromoforów DA.Ponadto pseudooktaedryczna półkanapkowa struktura kompleksów metaloorganicznych Ru(II)-arenów może sterycznie zapobiegać agregacji H chromoforów typu DA, ułatwiając w ten sposób tworzenie agregacji J z przesuniętymi ku czerwieni pasmami absorpcji.Jednak nieodłączne wady kompleksów Ru(II)-aren, takie jak niska stabilność i/lub słaba biodostępność, mogą wpływać na skuteczność terapeutyczną i aktywność in vivo kompleksów aren-Ru(II).Jednak badania wykazały, że te wady można przezwyciężyć przez kapsułkowanie kompleksów rutenu biokompatybilnymi polimerami przez fizyczne kapsułkowanie lub kowalencyjne sprzęganie.
W tej pracy opisujemy sprzężone z DA kompleksy Ru(II)-aren (RuDA) z wyzwalaczem NIR poprzez wiązanie koordynacyjne między chromoforem DAD i ugrupowaniem Ru(II)-aren.Powstałe kompleksy mogą samoorganizować się w metalosupramolekularne pęcherzyki w wodzie w wyniku oddziaływań niekowalencyjnych.Warto zauważyć, że złożenie supramolekularne nadało RuDA właściwości krzyżowania międzysystemowego indukowane polimeryzacją, co znacznie zwiększyło wydajność ISC, co było bardzo korzystne dla PDT (ryc. 1A).Aby zwiększyć akumulację guza i biokompatybilność in vivo, do enkapsulacji RuDA47,48,49 zastosowano zatwierdzony przez FDA Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) w celu wytworzenia nanocząstek RuDA-NP (ryc. 1B), które działały jako wysoce wydajny PDT/podwójny tryb proxy PTT .W fototerapii raka (Figura 1C), RuDA-NP zastosowano do leczenia nagich myszy z guzami MDA-MB-231 w celu zbadania skuteczności PDT i PTT in vivo.
Schematyczna ilustracja mechanizmu fotofizycznego RuDA w postaci monomerycznej i zagregowanej w fototerapii nowotworów, synteza B RuDA-NP i C RuDA-NP dla PDT i PTT aktywowanych NIR.
RuDA, składający się z funkcjonalności TPA i TDP, przygotowano zgodnie z procedurą przedstawioną na rysunku uzupełniającym 1 (rysunek 2A), a RuDA scharakteryzowano za pomocą widm 1H i 13C NMR, spektrometrii masowej z jonizacją przez elektrorozpylanie i analizy elementarnej (rysunki uzupełniające 2-4 ).Mapa różnicy gęstości elektronowej RuDA najniższego przejścia singletowego została obliczona za pomocą teorii funkcjonału gęstości zależnej od czasu (TD-DFT) w celu zbadania procesu przenoszenia ładunku.Jak pokazano na dodatkowym rysunku 5, gęstość elektronowa dryfuje głównie od trifenyloaminy do jednostki akceptora TDP po fotowzbudzeniu, co można przypisać typowemu wewnątrzcząsteczkowemu przejściu ładunku (CT).
Budowa chemiczna rudy B Widma absorpcyjne rudy w mieszaninach o różnych proporcjach DMF i wody.C Znormalizowane wartości absorpcji RuDA (800 nm) i ICG (779 nm) w funkcji czasu przy 0,5 W cm-2 światła laserowego 808 nm.D Na fotodegradację ABDA wskazuje indukowane RuDA tworzenie 1O2 w mieszaninach DMF/H2O o różnej zawartości wody pod działaniem promieniowania laserowego o długości fali 808 nm i mocy 0,5 W/cm2.
Streszczenie – Do badania właściwości samoorganizacji Rudy w mieszaninach DMF i wody w różnych proporcjach wykorzystano spektroskopię absorpcji światła widzialnego UV.Jak pokazano na ryc.2B, RuDA wykazuje pasma absorpcji od 600 do 900 nm w DMF z maksymalnym pasmem absorpcji przy 729 nm.Zwiększenie ilości wody doprowadziło do stopniowego przesunięcia ku czerwieni maksimum absorpcji rudy do 800 nm, co wskazuje na agregację J rudy w zmontowanym układzie.Widma fotoluminescencji RuDA w różnych rozpuszczalnikach pokazano na rysunku uzupełniającym 6. RuDA wydaje się wykazywać typową luminescencję NIR-II z maksymalną długością fali emisji około.1050 nm odpowiednio w CH2Cl2 i CH3OH.Duże przesunięcie Stokesa (około 300 nm) RuDA wskazuje na istotną zmianę geometrii stanu wzbudzonego i powstawanie niskoenergetycznych stanów wzbudzonych.Wydajności kwantowe luminescencji Rudy w CH2Cl2 i CH3OH zostały określone na odpowiednio 3,3 i 0,6%.Natomiast w mieszaninie metanolu i wody (5/95, v/v) zaobserwowano nieznaczne przesunięcie ku czerwieni emisji i spadek wydajności kwantowej (0,22%), co może wynikać z samoorganizacji Rudy. .
Aby zwizualizować samoorganizację ORE, wykorzystaliśmy mikroskopię sił atomowych w cieczy (AFM) do wizualizacji zmian morfologicznych w ORE w roztworze metanolu po dodaniu wody.Gdy zawartość wody była poniżej 80%, nie zaobserwowano wyraźnej agregacji (rysunek uzupełniający 7).Jednak wraz z dalszym wzrostem zawartości wody do 90–95% pojawiły się małe nanocząstki, które wskazywały na samoorganizację Rudy. Ponadto napromieniowanie laserem o długości fali 808 nm nie wpłynęło na intensywność absorpcji RuDA w wodzie rozwiązanie (rys. 2C i rys. uzupełniający 8).W przeciwieństwie do tego, absorbancja zieleni indocyjaniny (ICG jako kontrola) gwałtownie spadła przy 779 nm, co wskazuje na doskonałą fotostabilność RuDA.Ponadto stabilność RuDA-NPs w PBS (pH = 5,4, 7,4 i 9,0), 10% FBS i DMEM (wysoki poziom glukozy) zbadano za pomocą spektroskopii absorpcyjnej UV-widzialnej w różnych punktach czasowych.Jak pokazano na Figurze Uzupełniającej 9, niewielkie zmiany w pasmach absorpcji RuDA-NP zaobserwowano w PBS przy pH 7,4/9,0, FBS i DMEM, co wskazuje na doskonałą stabilność RuDA-NP.Natomiast w środowisku kwaśnym (pН = 5,4) stwierdzono hydrolizę Rudy.Przeprowadziliśmy również dalszą ocenę stabilności RuDA i RuDA-NP przy użyciu metod wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).Jak pokazano na Rycinie Uzupełniającej 10, RuDA była stabilna w mieszaninie metanolu i wody (50/50, v/v) przez pierwszą godzinę, a hydrolizę zaobserwowano po 4 godzinach.Jednak dla nanocząstek RuDA zaobserwowano tylko szeroki wklęsło-wypukły pik.Dlatego też do oceny stabilności NP RuDA w PBS (pH = 7,4) zastosowano chromatografię żelowo-permeacyjną (GPC).Jak pokazano na Rycinie Uzupełniającej 11, po 8 godzinach inkubacji w badanych warunkach wysokość piku, szerokość piku i powierzchnia piku NP RuDA nie zmieniły się znacząco, co wskazuje na doskonałą stabilność NP RuDA.Ponadto obrazy TEM pokazały, że morfologia nanocząstek RuDA-NP pozostała praktycznie niezmieniona po 24 godzinach w rozcieńczonym buforze PBS (pH = 7,4, uzupełniająca ryc. 12).
Ponieważ samoorganizacja może nadać Rudzie różne właściwości funkcjonalne i chemiczne, zaobserwowaliśmy uwalnianie kwasu 9,10-antracenodiylobis(metyleno)dimalonowego (ABDA, wskaźnik 1O2) w mieszaninach metanol-woda.Ruda o różnej zawartości wody50.Jak pokazano na rysunku 2D i rysunku uzupełniającym 13, nie zaobserwowano degradacji ABDA, gdy zawartość wody była poniżej 20%.Wraz ze wzrostem wilgotności do 40% nastąpiła degradacja ABDA, o czym świadczy spadek intensywności fluorescencji ABDA.Zaobserwowano również, że wyższa zawartość wody powoduje szybszą degradację, co sugeruje, że samoorganizacja RuDA jest konieczna i korzystna dla degradacji ABDA.Zjawisko to bardzo różni się od nowoczesnych chromoforów ACQ (wygaszanie indukowane agregacją).Po naświetleniu laserem o długości fali 808 nm wydajność kwantowa 1O2 RuDA w mieszaninie 98% H2O/2% DMF wynosi 16,4%, czyli jest 82 razy wyższa niż w przypadku ICG (ΦΔ = 0,2%)51, wykazując niezwykłą sprawność wytwarzania 1O2 RuDA w stanie agregacji.
Spiny elektronów z użyciem 2,2,6,6-tetrametylo-4-piperydynonu (TEMP) i N-tlenku 5,5-dimetylo-1-piroliny (DMPO) jako pułapek spinowych Spektroskopia rezonansowa (ESR) została wykorzystana do identyfikacji powstałych indywiduów AFK.przez RuDA.Jak pokazano na dodatkowym rysunku 14, potwierdzono, że 1O2 jest generowany w czasie naświetlania od 0 do 4 minut.Ponadto, gdy RuDA inkubowano z DMPO pod wpływem napromieniania, wykryto typowy czteroliniowy sygnał EPR 1:2:2:1 adduktu DMPO-OH·, co wskazuje na tworzenie rodników hydroksylowych (OH·).Podsumowując, powyższe wyniki wskazują na zdolność RuDA do stymulowania produkcji ROS poprzez podwójny proces fotouczulania typu I/II.
Aby lepiej zrozumieć właściwości elektronowe RuDA w postaciach monomerycznych i zagregowanych, obliczono graniczne orbitale molekularne RuDA w postaciach monomerycznych i dimerycznych metodą DFT.Jak pokazano na ryc.3A, najwyższy zajęty orbital molekularny (HOMO) monomerycznej RuDA jest zdelokalizowany wzdłuż szkieletu ligandu, a najniższy niezajęty orbital molekularny (LUMO) jest wyśrodkowany na jednostce akceptora TDP.Wręcz przeciwnie, gęstość elektronowa w dimerycznej HOMO jest skoncentrowana na ligandzie jednej cząsteczki RuDA, podczas gdy gęstość elektronowa w LUMO koncentruje się głównie na jednostce akceptorowej innej cząsteczki RuDA, co wskazuje, że RuDA znajduje się w dimerze.Cechy CT.
A HOMO i LUMO rudy są obliczane w postaci monomerycznej i dimerycznej.B Singletowe i tripletowe poziomy energetyczne Rudy w monomerach i dimerach.C Szacowane poziomy RuDA i możliwych kanałów ISC jako monomeryczne C i dimeryczne D. Strzałki wskazują możliwe kanały ISC.
Rozkład elektronów i dziur w niskoenergetycznych singletowych stanach wzbudzonych RuDA w postaci monomerycznej i dimerycznej analizowano za pomocą oprogramowania Multiwfn 3.852.53, które obliczono metodą TD-DFT.Jak wskazano na dodatkowej etykiecie.Jak pokazano na rysunkach 1-2, monomeryczne dziury RDA są w większości zdelokalizowane wzdłuż szkieletu ligandu w tych singletowych stanach wzbudzonych, podczas gdy elektrony są głównie zlokalizowane w grupie TDP, wykazując wewnątrzcząsteczkową charakterystykę CT.Ponadto, w przypadku tych singletowych stanów wzbudzonych, dziury i elektrony nakładają się w mniejszym lub większym stopniu, co sugeruje, że te singletowe stany wzbudzone mają pewien wkład ze wzbudzenia lokalnego (LE).W przypadku dimerów, poza cechami wewnątrzcząsteczkowymi CT i LE, pewien odsetek cech międzycząsteczkowych CT zaobserwowano w poszczególnych stanach, zwłaszcza S3, S4, S7 i S8, na podstawie analizy międzycząsteczkowej CT, z przejściami międzycząsteczkowymi CT jako głównymi (Tabela uzupełniająca).3).
Aby lepiej zrozumieć wyniki eksperymentalne, zbadaliśmy dalej właściwości stanów wzbudzonych RuDA, aby zbadać różnice między monomerami i dimerami (tabele uzupełniające 4–5).Jak pokazano na rysunku 3B, poziomy energetyczne stanów wzbudzonych singletowych i tripletowych dimeru są znacznie gęstsze niż poziomy monomeru, co pomaga zmniejszyć przerwę energetyczną między S1 i Tn. Doniesiono, że przejścia ISC mogą być realizowane przy małej przerwie energetycznej (ΔES1-Tn < 0,3 eV) między S1 a Tn54. Doniesiono, że przejścia ISC mogą być realizowane w małej przerwie energetycznej (ΔES1-Tn < 0,3 eV) między S1 a Tn54. Сообщалось, опереходы ISC mogut переализованы w предела небольшой энергетической щели (Δели ели елин, елин, ели, ели ели ели елин, ели ели, 3 Doniesiono, że przejścia ISC mogą być realizowane w małej przerwie energetycznej (ΔES1-Tn <0,3 eV) między S1 a Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Сообщалось, то переход ISC moete пеализован w предела небольш энергетической щели (ΔES1-Tn < 0,3 ) Doniesiono, że przejście ISC może być realizowane w ramach małej przerwy energetycznej (ΔES1-Tn < 0,3 eV) między S1 a Tn54.Dodatkowo, tylko jeden orbital, zajęty lub niezajęty, musi różnić się stanami związanymi singletami i trypletami, aby zapewnić niezerową całkę SOC.Tak więc, na podstawie analizy energii wzbudzenia i przejścia orbitalnego, wszystkie możliwe kanały przejścia ISC pokazano na rys.3C,D.Warto zauważyć, że w monomerze dostępny jest tylko jeden kanał ISC, podczas gdy postać dimeryczna ma cztery kanały ISC, które mogą wzmocnić przejście ISC.Dlatego rozsądnie jest założyć, że im więcej cząsteczek RuDA jest zagregowanych, tym bardziej dostępne będą kanały ISC.Dlatego agregaty RuDA mogą tworzyć dwupasmowe struktury elektroniczne w stanach singletowych i tripletowych, zmniejszając lukę energetyczną między S1 a dostępną Tn, zwiększając w ten sposób wydajność ISC w celu ułatwienia generowania 1O2.
Aby dokładniej wyjaśnić mechanizm leżący u podstaw, zsyntetyzowaliśmy związek odniesienia kompleksu aren-Ru(II) (RuET), zastępując dwie grupy etylowe dwiema grupami trifenyloaminy fenylowej w RuDA (ryc. 4A, pełna charakterystyka, patrz ESI, Uzupełnienie 15 -21 ) Od donora (dietyloaminy) do akceptora (TDF), RuET ma takie same właściwości wewnątrzcząsteczkowego CT jak RuDA.Zgodnie z oczekiwaniami widmo absorpcyjne RuET w DMF wykazało pasmo przenoszenia ładunku o niskiej energii z silną absorpcją w obszarze bliskiej podczerwieni w zakresie 600–1100 nm (rys. 4B).Ponadto agregację RuET obserwowano również wraz ze wzrostem zawartości wody, co znalazło odzwierciedlenie w przesunięciu ku czerwieni maksimum absorpcji, co zostało dodatkowo potwierdzone przez obrazowanie w płynie AFM (rysunek uzupełniający 22).Wyniki pokazują, że RuET, podobnie jak RuDA, może tworzyć stany wewnątrzcząsteczkowe i samoorganizować się w zagregowane struktury.
Struktura chemiczna RuET.B Widma absorpcyjne RuET w mieszaninach o różnych proporcjach DMF i wody.Wykresy C EIS Nyquist dla RuDA i RuET.Reakcje fotoprądowe D RuDA i RuET pod działaniem promieniowania laserowego o długości fali 808 nm.
Fotodegradację ABDA w obecności RuET oceniano przez naświetlanie laserem o długości fali 808 nm.Co zaskakujące, nie zaobserwowano degradacji ABDA w różnych frakcjach wody (rysunek uzupełniający 23).Możliwym powodem jest to, że RuET nie może skutecznie tworzyć pasmowej struktury elektronowej, ponieważ łańcuch etylowy nie sprzyja wydajnemu transferowi ładunków międzycząsteczkowych.W związku z tym przeprowadzono elektrochemiczną spektroskopię impedancyjną (EIS) i przejściowe pomiary fotoprądu w celu porównania właściwości fotoelektrochemicznych RuDA i RuET.Zgodnie z wykresem Nyquista (Rysunek 4C), RuDA wykazuje znacznie mniejszy promień niż RuET, co oznacza, że RuDA56 ma szybszy międzycząsteczkowy transport elektronów i lepsze przewodnictwo.Ponadto gęstość fotoprądu RuDA jest znacznie wyższa niż gęstość RuET (ryc. 4D), co potwierdza lepszą wydajność transferu ładunku RuDA57.Tak więc grupa fenylowa trifenyloaminy w rudzie odgrywa ważną rolę w zapewnianiu międzycząsteczkowego transferu ładunku i tworzeniu pasmowej struktury elektronowej.
Aby zwiększyć akumulację guza i biokompatybilność in vivo, dodatkowo kapsułkowaliśmy RuDA z F127.Średnia hydrodynamiczna średnica RuDA-NP została określona na 123,1 nm z wąskim rozkładem (PDI = 0,089) przy użyciu metody dynamicznego rozpraszania światła (DLS) (Figura 5A), która promowała akumulację guza poprzez zwiększenie przepuszczalności i retencji.EPR).Obrazy TEM wykazały, że nanocząsteczki rudy mają jednorodny kulisty kształt o średniej średnicy 86 nm.Warto zauważyć, że maksimum absorpcji RuDA-NP pojawiło się przy 800 nm (rysunek uzupełniający 24), wskazując, że RuDA-NP mogą zachowywać funkcje i właściwości samoorganizujących się RuDA.Obliczona wydajność kwantowa ROS dla rudy NP wynosi 15,9%, co jest porównywalne z rudą. Właściwości fototermiczne NP RuDA badano pod działaniem promieniowania laserowego o długości fali 808 nm za pomocą kamery na podczerwień.Jak pokazano na ryc.5B,C, grupa kontrolna (tylko PBS) doświadczyła niewielkiego wzrostu temperatury, podczas gdy temperatura roztworu RuDA-NPs gwałtownie wzrosła wraz ze wzrostem temperatury (ΔT) do 15,5, 26,1 i 43,0°C.Wysokie stężenia wynosiły odpowiednio 25, 50 i 100 µM, co wskazuje na silny efekt fototermiczny nanocząstek RuDA.Ponadto przeprowadzono pomiary cyklu ogrzewania/chłodzenia w celu oceny fototermicznej stabilności RuDA-NP i porównania z ICG.Temperatura NP Rudy nie spadła po pięciu cyklach ogrzewania/chłodzenia (ryc. 5D), co wskazuje na doskonałą stabilność fototermiczną NP Rudy.W przeciwieństwie do tego, ICG wykazuje niższą stabilność fototermiczną, co widać po widocznym zaniku plateau temperatury fototermicznej w tych samych warunkach.Zgodnie z poprzednią metodą58, wydajność konwersji fototermicznej (PCE) RuDA-NP obliczono na 24,2%, czyli więcej niż w przypadku istniejących materiałów fototermicznych, takich jak złote nanopręty (21,0%) i złote nanopowłoki (13,0%)59.Tak więc NP Ore wykazują doskonałe właściwości fototermiczne, co czyni je obiecującymi środkami PTT.
Analiza obrazów DLS i TEM nanocząstek RuDA (wstawka).B Obrazy termiczne różnych stężeń nanocząstek RuDA wystawionych na działanie promieniowania laserowego o długości fali 808 nm (0,5 W cm-2).C Krzywe konwersji fototermicznej dla różnych stężeń nanocząstek rudy, które są danymi ilościowymi.B. D Wzrost temperatury ORE NP i ICG w ciągu 5 cykli grzania-chłodzenia.
Fotocytotoksyczność nanocząstek RuDA wobec ludzkich komórek raka piersi MDA-MB-231 została oceniona in vitro.Jak pokazano na ryc.6A, B, RuDA-NP i RuDA wykazywały znikomą cytotoksyczność przy braku napromieniowania, co sugeruje niższą toksyczność w ciemności RuDA-NP i RuDA.Jednak po ekspozycji na promieniowanie laserowe o długości fali 808 nm, nanocząsteczki RuDA i RuDA wykazały silną fotocytotoksyczność wobec komórek nowotworowych MDA-MB-231 z wartościami IC50 (połowa maksymalnego stężenia hamującego) odpowiednio 5,4 i 9,4 μM, wykazując że RuDA-NP i RuDA mają potencjał do fototerapii nowotworów.Dodatkowo, fotocytotoksyczność RuDA-NP i RuDA była dalej badana w obecności witaminy C (Vc), zmiatacza ROS, w celu wyjaśnienia roli ROS w cytotoksyczności indukowanej światłem.Oczywiście żywotność komórek wzrosła po dodaniu Vc, a wartości IC50 dla nanocząsteczek RuDA i RuDA wyniosły odpowiednio 25,7 i 40,0 μM, co świadczy o ważnej roli ROS w fototoksyczności nanocząsteczek RuDA i RuDA.Cytotoksyczność indukowana światłem RuDA-NP i RuDA w komórkach rakowych MDA-MB-231 przez barwienie żywych/martwych komórek przy użyciu kalceiny AM (zielona fluorescencja żywych komórek) i jodku propidyny (PI, czerwona fluorescencja martwych komórek).potwierdzone przez komórki) jako sondy fluorescencyjne.Jak pokazano na Figurze 6C, komórki traktowane RuDA-NP lub RuDA pozostały żywotne bez napromieniania, o czym świadczy intensywna zielona fluorescencja.Wręcz przeciwnie, pod wpływem naświetlania laserem zaobserwowano jedynie czerwoną fluorescencję, co potwierdza efektywną fotocytotoksyczność nanocząstek RuDA lub RuDA.Warto zauważyć, że po dodaniu Vc pojawiła się zielona fluorescencja, co wskazuje na naruszenie fotocytotoksyczności nanocząstek RuDA i RuDA.Wyniki te są zgodne z testami fotocytotoksyczności in vitro.
Zależna od dawki żywotność komórek A RuDA- i B RuDA-NP w komórkach MDA-MB-231 odpowiednio w obecności lub nieobecności Vc (0,5 mM).Słupki błędów, średnia ± odchylenie standardowe (n = 3). Niesparowane, dwustronne testy t *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Niesparowane, dwustronne testy t *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. епарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Niesparowane dwustronne testy t *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Testy dwuokresowe *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Niesparowane dwustronne testy t *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.C Analiza barwienia żywych/martwych komórek przy użyciu kalceiny AM i jodku propidyny jako sond fluorescencyjnych.Skala: 30 µm.Przedstawiono reprezentatywne obrazy trzech powtórzeń biologicznych z każdej grupy.D Obrazy fluorescencyjne konfokalne wytwarzania ROS w komórkach MDA-MB-231 w różnych warunkach leczenia.Zielona fluorescencja DCF wskazuje na obecność ROS.Naświetlaj laserem o długości fali 808 nm o mocy 0,5 W/cm2 przez 10 minut (300 J/cm2).Skala: 30 µm.Przedstawiono reprezentatywne obrazy trzech powtórzeń biologicznych z każdej grupy.E Cytometria przepływowa Analiza traktowania RuDA-NPs (50 µM) lub RuDA (50 µM) z laserem 808 nm lub bez (0,5 W cm-2) w obecności i przy braku Vc (0,5 mM) przez 10 min.Przedstawiono reprezentatywne obrazy trzech powtórzeń biologicznych z każdej grupy.F Nrf-2, HSP70 i HO-1 komórek MDA-MB-231 traktowanych RuDA-NP (50 µM) z lub bez naświetlania laserem 808 nm (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2) , komórki wyrażają 2).Przedstawiono reprezentatywne obrazy dwóch powtórzeń biologicznych z każdej grupy.
Wewnątrzkomórkową produkcję ROS w komórkach MDA-MB-231 badano metodą barwienia dioctanem 2,7-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA).Jak pokazano na ryc.6D, komórki traktowane RuDA-NP lub RuDA wykazywały wyraźną zieloną fluorescencję po napromieniowaniu laserem 808 nm, co wskazuje, że RuDA-NP i RuDA mają wydajną zdolność do wytwarzania ROS.Wręcz przeciwnie, przy braku światła lub w obecności Vc obserwowano jedynie słaby sygnał fluorescencyjny komórek, co wskazywało na nieznaczne tworzenie ROS.Wewnątrzkomórkowe poziomy ROS w komórkach RuDA-NP i traktowanych RuDA komórkach MDA-MB-231 określano dalej za pomocą cytometrii przepływowej.Jak pokazano na Rycinie Uzupełniającej 25, średnia intensywność fluorescencji (MFI) generowana przez RuDA-NP i RuDA pod napromieniowaniem laserem 808 nm została znacząco zwiększona odpowiednio około 5,1 i 4,8 razy w porównaniu z grupą kontrolną, potwierdzając ich doskonałe tworzenie AFK.Pojemność.Jednak wewnątrzkomórkowe poziomy ROS w komórkach RuDA-NP lub MDA-MB-231 traktowanych RuDA były porównywalne tylko z kontrolami bez naświetlania laserem lub w obecności Vc, podobnie jak wyniki analizy fluorescencji konfokalnej.
Wykazano, że głównym celem kompleksów Ru(II)-aren są mitochondria60.Dlatego zbadano subkomórkową lokalizację RuDA i RuDA-NP.Jak pokazano na Rycinie Uzupełniającej 26, RuDA i RuDA-NP wykazują podobne profile dystrybucji komórkowej z najwyższą akumulacją w mitochondriach (odpowiednio 62,5 ± 4,3 i 60,4 ± 3,6 ng/mg białka).Jednak tylko niewielka ilość Ru została znaleziona we frakcjach jądrowych Rudy i NP Rudy (odpowiednio 3,5 i 2,1%).Pozostała frakcja komórek zawierała resztkowy ruten: 31,7% (30,6 ± 3,4 ng/mg białka) dla RuDA i 42,9% (47,2 ± 4,5 ng/mg białka) dla RuDA-NP.Ogólnie rzecz biorąc, Ruda i Ruda NP są gromadzone głównie w mitochondriach.Aby ocenić dysfunkcję mitochondriów, użyliśmy barwienia JC-1 i MitoSOX Red, aby ocenić odpowiednio potencjał błony mitochondrialnej i zdolność do produkcji ponadtlenków.Jak pokazano na dodatkowym ryc. 27, intensywną zieloną (JC-1) i czerwoną (MitoSOX Red) fluorescencję zaobserwowano w komórkach traktowanych zarówno RuDA, jak i RuDA-NP pod promieniowaniem laserowym 808 nm, co wskazuje, że zarówno RuDA, jak i RuDA-NPs są wysoce fluorescencyjne. Może skutecznie indukować depolaryzację błony mitochondrialnej i produkcję ponadtlenków.Ponadto mechanizm śmierci komórek określono za pomocą analizy aneksyny V-FITC/jodku propidyny (PI) opartej na cytometrii przepływowej.Jak pokazano na Figurze 6E, po naświetleniu laserem 808 nm, RuDA i RuDA-NP indukowały znacząco zwiększoną wczesną apoptozę (dolny prawy kwadrant) w komórkach MDA-MB-231 w porównaniu z PBS lub PBS plus laser.przetworzone komórki.Jednak po dodaniu Vc wskaźnik apoptozy RuDA i RuDA-NP znacząco spadł z odpowiednio 50,9% i 52,0% do 15,8% i 17,8%, co potwierdza istotną rolę ROS w fototoksyczności RuDA i RuDA-NP..Ponadto we wszystkich badanych grupach zaobserwowano nieznaczne komórki martwicze (górny lewy kwadrant), co sugeruje, że apoptoza może być dominującą formą śmierci komórek indukowaną przez RuDA i RuDA-NP.
Ponieważ uszkodzenie spowodowane stresem oksydacyjnym jest głównym wyznacznikiem apoptozy, zbadano czynnik jądrowy związany z erytroidem 2, czynnikiem 2 (Nrf2) 62, kluczowym regulatorem układu antyoksydacyjnego, w MDA-MB-231 traktowanych RuDA-NPs.Mechanizm działania nanocząstek RuDA indukowany przez naświetlanie.W tym samym czasie wykryto również ekspresję niższego białka oksygenazy hemowej 1 (HO-1).Jak pokazano na rycinie 6F i rycinie uzupełniającej 29, fototerapia za pośrednictwem RuDA-NP zwiększyła poziomy ekspresji Nrf2 i HO-1 w porównaniu z grupą PBS, co wskazuje, że RuDA-NP mogą stymulować szlaki sygnalizacji stresu oksydacyjnego.Ponadto, aby zbadać efekt fototermiczny RuDA-NPs63, oceniono również ekspresję białka szoku cieplnego Hsp70.Oczywiste jest, że komórki poddane działaniu RuDA-NPs + napromienianie laserem 808 nm wykazywały zwiększoną ekspresję Hsp70 w porównaniu z pozostałymi dwiema grupami, co odzwierciedla odpowiedź komórkową na hipertermię.
Niezwykłe wyniki in vitro skłoniły nas do zbadania działania RuDA-NP in vivo u nagich myszy z guzami MDA-MB-231.Dystrybucję tkankową nanocząstek RuDA badano przez określenie zawartości rutenu w wątrobie, sercu, śledzionie, nerkach, płucach i nowotworach.Jak pokazano na ryc.7A, maksymalna zawartość Ore NPs w prawidłowych narządach pojawiła się w pierwszym czasie obserwacji (4 h), podczas gdy maksymalna zawartość została określona w tkankach guza 8 godzin po wstrzyknięciu, prawdopodobnie z powodu Ore NPs.Efekt EPR LF.Zgodnie z wynikami dystrybucji optymalny czas leczenia rudą NP przyjęto 8 godzin po podaniu.Aby zilustrować proces akumulacji RuDA-NP w miejscach guza, właściwości fotoakustyczne (PA) RuDA-NP monitorowano przez rejestrowanie sygnałów PA RuDA-NP w różnych momentach po wstrzyknięciu.Po pierwsze, sygnał PA RuDA-NP in vivo oceniano przez rejestrowanie obrazów PA miejsca guza po donowotworowej iniekcji RuDA-NP.Jak pokazano na Rycinie Uzupełniającej 30, RuDA-NP wykazywały silny sygnał PA i istniała dodatnia korelacja między stężeniem RuDA-NP a intensywnością sygnału PA (Rycina uzupełniająca 30A).Następnie rejestrowano obrazy PA in vivo miejsc nowotworowych po dożylnym wstrzyknięciu RuDA i RuDA-NP w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu.Jak pokazano na Figurze 7B, sygnał PA RuDA-NP z miejsca guza stopniowo wzrastał z czasem i osiągnął plateau po 8 godzinach po wstrzyknięciu, zgodnie z wynikami dystrybucji tkankowej określonymi przez analizę ICP-MS.W odniesieniu do RuDA (rysunek uzupełniający 30B), maksymalna intensywność sygnału PA pojawiła się 4 godziny po wstrzyknięciu, wskazując na szybkie tempo wnikania RuDA do guza.Ponadto zbadano zachowanie wydalnicze RuDA i RuDA-NP poprzez określenie ilości rutenu w moczu i kale za pomocą ICP-MS.Główną drogą eliminacji RuDA (ryc. uzupełniający. 31) i RuDA-NP (ryc. 7C) jest kał. a RuDA-NPs mogą być skutecznie eliminowane z organizmu bez długotrwałej toksyczności.
A. Dystrybucję RuDA-NP ex vivo w tkankach myszy określono na podstawie zawartości Ru (procent podanej dawki Ru (ID) na gram tkanki) w różnym czasie po wstrzyknięciu.Dane to średnia ± odchylenie standardowe (n = 3). Niesparowane, dwustronne testy t *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Niesparowane, dwustronne testy t *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. епарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Niesparowane dwustronne testy t *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Testy dwuokresowe *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Niesparowane dwustronne testy t *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.Obrazy BPA miejsc guza in vivo przy wzbudzeniu 808 nm po dożylnym podaniu RuDA-NP (10 µmol kg-1) w różnych punktach czasowych.Po dożylnym podaniu NP RuDA (10 µmol kg-1), C Ru był wydalany z myszy z moczem i kałem w różnych odstępach czasu.Dane to średnia ± odchylenie standardowe (n = 3).
Dla porównania pojemność grzewczą RuDA-NP in vivo badano na nagich myszach z guzami MDA-MB-231 i RuDA.Jak pokazano na ryc.8A i uzupełniający Ryc. 32, grupa kontrolna (sól fizjologiczna) wykazała mniejszą zmianę temperatury (ΔT ≈ 3 °C) po 10 minutach ciągłej ekspozycji.Jednak temperatura RuDA-NP i RuDA gwałtownie wzrosła, przy maksymalnych temperaturach odpowiednio 55,2 i 49,9°C, zapewniając wystarczającą hipertermię do leczenia raka in vivo.Obserwowany wzrost wysokiej temperatury dla nanocząstek RuDA (ΔT ≈ 24°C) w porównaniu z RuDA (ΔT ≈ 19°C) może wynikać z jego lepszej przepuszczalności i akumulacji w tkankach nowotworowych dzięki efektowi EPR.
Obrazy termowizyjne w podczerwieni myszy z guzami MDA-MB-231 napromieniowanych laserem 808 nm w różnym czasie 8 godzin po wstrzyknięciu.Przedstawiono reprezentatywne obrazy czterech powtórzeń biologicznych z każdej grupy.B Względna objętość guza i C Średnia masa guza różnych grup myszy podczas leczenia.D Krzywe masy ciała różnych grup myszy.Naświetlaj laserem o długości fali 808 nm o mocy 0,5 W/cm2 przez 10 minut (300 J/cm2).Słupki błędów, średnia ± odchylenie standardowe (n = 3). Niesparowane, dwustronne testy t *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Niesparowane, dwustronne testy t *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. епарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Niesparowane dwustronne testy t *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Testy dwuokresowe *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Niesparowane dwustronne testy t *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001. Obrazy barwienia E H&E głównych narządów i guzów z różnych grup terapeutycznych, w tym z grup soli fizjologicznej, soli fizjologicznej + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NP i RuDA-NP + laser. Obrazy barwienia E H&E głównych narządów i guzów z różnych grup terapeutycznych, w tym z grup soli fizjologicznej, soli fizjologicznej + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NP i RuDA-NP + laser. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. Obrazy barwienia E H&E głównych narządów i guzów z różnych grup terapeutycznych, w tym z grup soli fizjologicznej, soli fizjologicznej + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + laser.来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E 染色图像，包括盐水、盐水+ 激光、RuDA、RuDA + 激光、RuDA-NP 和RuDA-NP + 激光组。来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. Barwienie E H&E głównych narządów i guzów z różnych grup terapeutycznych, w tym sól fizjologiczna, sól fizjologiczna + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + laser.Skala: 60 µm.
Oceniono efekt fototerapii in vivo z użyciem nanocząstek RuDA i RuDA, w których nagim myszom z guzami MDA-MB-231 wstrzyknięto dożylnie przez żyłę ogonową NP RuDA lub RuDA w pojedynczej dawce 10,0 µmol kg-1, a następnie 8 godzin po wstrzyknięciu.promieniowanie laserowe o długości fali 808 nm.Jak pokazano na Figurze 8B, objętości guza były znacząco zwiększone w grupach solanki i lasera, co wskazuje, że napromienianie solą fizjologiczną lub laserem 808 miało niewielki wpływ na wzrost guza.Podobnie jak w grupie z solą fizjologiczną, szybki wzrost guza zaobserwowano również u myszy leczonych RuDA-NPs lub RuDA przy braku naświetlania laserem, wykazując ich niską toksyczność w ciemności.W przeciwieństwie do tego, po napromieniowaniu laserem, zarówno leczenie RuDA-NP, jak i RuDA wywołały znaczną regresję guza ze zmniejszeniem objętości guza odpowiednio o 95,2% i 84,3% w porównaniu z grupą leczoną solą fizjologiczną, co wskazuje na doskonałą synergiczną PDT., za pośrednictwem efektu RuDA/CHTV.– NP lub Ore. W porównaniu z RuDA, RuDA NP wykazywały lepszy efekt fototerapeutyczny, co wynikało głównie z efektu EPR NP RuDA.Wyniki hamowania wzrostu guza oceniano dalej na podstawie masy guza wyciętego w 15 dniu leczenia (fig. 8C i uzupełniający ryc. 33).Średnia masa guza u myszy leczonych RuDA-NP i myszy leczonych RuDA wynosiła odpowiednio 0,08 i 0,27 g, co było znacznie lżejsze niż w grupie kontrolnej (1,43 g).
Ponadto co trzy dni rejestrowano masę ciała myszy w celu zbadania ciemnej toksyczności RuDA-NP lub RuDA in vivo.Jak pokazano na Figurze 8D, nie zaobserwowano znaczących różnic w masie ciała dla wszystkich leczonych grup. Ponadto przeprowadzono barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) głównych narządów (serca, wątroby, śledziony, płuca i nerek) z różnych leczonych grup. Ponadto przeprowadzono barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) głównych narządów (serca, wątroby, śledziony, płuca i nerki) z różnych leczonych grup. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сеппердца, печение, селезены) Ponadto przeprowadzono barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) głównych narządów (serca, wątroby, śledziony, płuc i nerek) z różnych leczonych grup.(H&E) 染色。 (ON) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печение, селезеныелины, логи) Ponadto, w różnych leczonych grupach przeprowadzono barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) głównych narządów (serca, wątroby, śledziony, płuc i nerek).Jak pokazano na ryc.8E, obrazy barwione H&E pięciu głównych narządów z grup RuDA-NP i RuDA nie wykazują żadnych oczywistych nieprawidłowości ani uszkodzeń narządów. 8E, obrazy barwione H&E pięciu głównych narządów z grup RuDA-NP i RuDA nie wykazują żadnych oczywistych nieprawidłowości ani uszkodzeń narządów.Jak pokazano na ryc.8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NPs i RuDA не демонстрируют явных аномалирины. 8E, H&E obrazy barwione pięciu głównych narządów z grup RuDA-NP i RuDA nie wykazują wyraźnych nieprawidłowości lub zmian narządowych.如图8E 所示，来自RuDA-NP 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示出明显的异常或器官损伤。如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Как показано на рисунке 8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NPs i RuDA не посновных org. Jak pokazano na rycinie 8E, obrazy barwione H&E pięciu głównych narządów z grup RuDA-NP i RuDA nie wykazały żadnych oczywistych nieprawidłowości ani uszkodzeń narządów.Wyniki te wykazały, że ani RuDA-NP, ani RuDA nie wykazywały oznak toksyczności in vivo. Co więcej, obrazy guzów z barwienia H&E wykazały, że zarówno grupy RuDA + Laser, jak i RuDA-NP + Laser mogą powodować poważne niszczenie komórek rakowych, wykazując doskonałą skuteczność fototerapeutyczną in vivo RuDA i RuDA-NP. Co więcej, obrazy guzów z barwienia H&E wykazały, że zarówno grupy RuDA + Laser, jak i RuDA-NP + Laser mogą powodować poważne niszczenie komórek rakowych, wykazując doskonałą skuteczność fototerapeutyczną in vivo RuDA i RuDA-NP.Ponadto obrazy guzów barwione hematoksyliną-eozyną wykazały, że zarówno grupy RuDA+Laser, jak i RuDA-NP+Laser mogą wywoływać poważne zniszczenie komórek rakowych, wykazując lepszą skuteczność fototerapeutyczną RuDA i RuDA-NP in vivo.此外，肿瘤的H&E 染色图像显示，RuDA + Laser 和RuDA-NP + Laser 组均可导致严重的癌细胞破坏，证明了RuDA 和RuDA-NP 的优异的体内光疗功效。此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 的 癌细胞 破坏 ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 光疗。。。。。。。。。。。。。 jaPonadto obrazy guzów barwionych hematoksyliną i eozyną wykazały, że zarówno grupy RuDA+Laser, jak i RuDA-NPs+Laser powodowały poważne zniszczenie komórek nowotworowych, wykazując lepszą skuteczność fototerapeutyczną RuDA i RuDA-NP in vivo.
Podsumowując, zaprojektowano kompleks metaloorganiczny Ru(II)-aren (RuDA) z ligandami typu DA w celu usprawnienia procesu ISC metodą agregacji.Zsyntetyzowane RuDA może samoorganizować się poprzez interakcje niekowalencyjne, tworząc pochodzące z RuDA układy supramolekularne, ułatwiając w ten sposób tworzenie 1O2 i wydajną konwersję fototermiczną w indukowanej światłem terapii przeciwnowotworowej.Warto zauważyć, że monomeryczna RuDA nie generowała 1O2 pod wpływem naświetlania laserem przy 808 nm, ale mogła generować dużą ilość 1O2 w stanie zagregowanym, co dowodzi racjonalności i skuteczności naszego projektu.Kolejne badania wykazały, że zespół supramolekularny nadaje RuDA ulepszone właściwości fotofizyczne i fotochemiczne, takie jak absorpcja przesunięcia ku czerwieni i odporność na fotowybielanie, które są bardzo pożądane w przetwarzaniu PDT i PTT.Doświadczenia zarówno in vitro, jak i in vivo wykazały, że NP RuDA o dobrej biokompatybilności i dobrej akumulacji w guzie wykazują doskonałe działanie przeciwnowotworowe indukowane światłem po napromieniowaniu laserem o długości fali 808 nm.Tak więc NP RuDA jako skuteczne bimodalne supramolekularne odczynniki PDT/PTW wzbogacą zestaw fotosensybilizatorów aktywowanych przy długości fali powyżej 800 nm.Koncepcyjny projekt układu supramolekularnego zapewnia wydajną drogę dla fotosensybilizatorów aktywowanych NIR o doskonałych efektach fotouczulających.
Wszystkie chemikalia i rozpuszczalniki uzyskano od dostawców komercyjnych i zastosowano bez dalszego oczyszczania.RuCl3 zakupiono od Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, Chiny).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolina-5,6-dion) i 4,7-bis[4-(N,N-difenyloamino)fenylo]-5 ,6-Diamino-2,1,3-benzotiadiazol zsyntetyzowano zgodnie z wcześniejszymi badaniami64,65.Widma NMR rejestrowano na spektrometrze Bruker Avance III-HD 600 MHz w Southeastern University Analytical Test Center stosując d6-DMSO lub CDCl3 jako rozpuszczalnik.Przesunięcia chemiczne δ podano w ppm.w odniesieniu do tetrametylosilanu, a stałe oddziaływania J podano w wartościach bezwzględnych w hercach.Spektrometrię masową wysokiej rozdzielczości (HRMS) przeprowadzono na aparacie Agilent 6224 ESI/TOF MS.Analizę elementarną C, H i N przeprowadzono na analizatorze elementarnym Vario MICROCHNOS (Elementar).Widma UV-widzialne mierzono na spektrofotometrze Shimadzu UV3600.Widma fluorescencji rejestrowano na spektrofluorymetrze Shimadzu RF-6000.Widma EPR rejestrowano na aparacie Bruker EMXmicro-6/1.Morfologię i strukturę przygotowanych próbek badano na przyrządach FEI Tecnai G20 (TEM) i Bruker Icon (AFM) pracujących przy napięciu 200 kV.Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) przeprowadzono na analizatorze Nanobrook Omni (Brookhaven).Właściwości fotoelektrochemiczne mierzono na układzie elektrochemicznym (CHI-660, Chiny).Obrazy fotoakustyczne uzyskano przy użyciu systemu FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.Obrazy konfokalne uzyskano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Olympus FV3000.Analizę FACS przeprowadzono na cytometrze przepływowym BD Calibur.Eksperymenty z wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC) przeprowadzono na systemie Waters Alliance e2695 przy użyciu detektora 2489 UV/Vis.Testy chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC) rejestrowano na aparacie Thermo ULTIMATE 3000 przy użyciu detektora współczynnika załamania światła ERC RefratoMax520.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolina-5,6-dion)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-difenyloamino)fenylo]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) i lodowaty kwas octowy (30 ml) mieszano pod chłodnicą zwrotną przez 12 godzin.Rozpuszczalnik następnie usunięto pod próżnią przy użyciu wyparki obrotowej.Otrzymaną pozostałość oczyszczono metodą szybkiej chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, CH2Cl2:MeOH=20:1), otrzymując RuDA w postaci zielonego proszku (wydajność: 877,5 mg, 80%).odbyt.Obliczono dla C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Znaleziono: C 67,92, H 4,26, N 9,82.1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13c NMR (150 MHZ, D6-DMSO), δ (PPM) 158,03, 152,81, 149,31, 147,98, 147,16, 139,98, 136,21, 135,57, 134,68, 130,34, 130,02, 128,68, 128,01, 125,51, 124,45, 120,81, 103,49, 103,49 , 103. , 86,52, 84,75, 63,29, 30,90, 22,29, 18,83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Synteza 4,7-bis[4-(N,N-dietyloamino)fenylo-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazolu (L2): L2 zsyntetyzowano w dwóch etapach.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) dodano do N,N-dietylo-4-(tributylostannylo)aniliny (1,05 g, 2,4 mmol) i roztworu 4,7-dibromo-5,6-dinitro - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) w suchym toluenie (100 ml).Mieszaninę mieszano w 100°C przez 24 godziny.Po usunięciu toluenu pod próżnią powstałą substancję stałą przemyto eterem naftowym.Następnie mieszaninę tego związku (234,0 mg, 0,45 mmola) i proszku żelaza (0,30 g, 5,4 mmola) w kwasie octowym (20 ml) mieszano w 80°C przez 4 godziny.Mieszaninę reakcyjną wlano do wody i powstałe brązowe ciało stałe zebrano przez filtrację.Produkt dwukrotnie oczyszczono metodą sublimacji próżniowej, w wyniku czego otrzymano zieloną substancję stałą (126,2 mg, wydajność 57%).odbyt.Obliczono dla C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Znaleziono: C 67,84, H 6,95, H 18,16.1H NMR (600 MHz, CDCI3), 5 (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13С NMR (150 MHz, CDCl3), δ (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Związki przygotowano i oczyszczono zgodnie z procedurami podobnymi do RuDA.odbyt.Obliczono dla C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Znaleziono: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81,1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), 8 (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13c NMR (151 mhz, CDCL3), δ (PPM) 158,20, 153,36, 148,82, 148,14, 138,59, 136,79, 135,75, 134,71, 130,44, 128,87, 128,35, 121,70, 111,84, 110,76, 105,07, 104,23, 87,0, 84,4., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA rozpuszczono w MeOH/H2O (5/95, v/v) w stężeniu 10 μM.Widmo absorpcyjne RuDA mierzono co 5 minut na spektrofotometrze Shimadzu UV-3600 przy naświetlaniu światłem laserowym o długości fali 808 nm (0,5 W/cm2).Widma ICG rejestrowano w takich samych warunkach jak standard.
Widma EPR rejestrowano na spektrometrze Bruker EMXmicro-6/1 o mocy mikrofal 20 mW, zakresie skanowania 100 G i modulacji pola 1 G. 2,2,6,6-tetrametylo-4-piperydon (TEMP) i N-tlenek 5,5-dimetylo-1-piroliny (DMPO) zastosowano jako pułapki wirowe.Widma elektronowego rezonansu spinowego rejestrowano dla mieszanych roztworów RuDA (50 µM) i TEMF (20 mM) lub DMPO (20 mM) pod działaniem promieniowania laserowego o długości fali 808 nm (0,5 W/cm2).
Obliczenia DFT i TD-DFT dla RuDA przeprowadzono przy poziomach PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ w roztworze wodnym za pomocą programu Gaussa 1666,67,68.Za pomocą programu GaussView (wersja 5.0) wykreślono rozkłady HOMO-LUMO, dziurowe i elektronowe singletowego stanu wzbudzonego RuDA o niskiej energii.
Najpierw próbowaliśmy zmierzyć wydajność wytwarzania 1O2 RuDA za pomocą konwencjonalnej spektroskopii UV-widzialnej z ICG (ΦΔ = 0,002) jako standardem, ale fotodegradacja ICG silnie wpłynęła na wyniki.Tak więc wydajność kwantową 1O2 RuDA zmierzono wykrywając zmianę natężenia fluorescencji ABDA przy około 428 nm po naświetleniu laserem o długości fali 808 nm (0,5 W/cm2).Eksperymenty przeprowadzono na nanocząsteczkach RuDA i RuDA (20 μM) w wodzie/DMF (98/2, v/v) zawierających ABDA (50 μM).Wydajność kwantową 1O2 obliczono ze wzoru: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS i rICG to szybkości reakcji ABDA z 102 uzyskane odpowiednio z fotosensybilizatora i ICG.APS i AICG to odpowiednio absorbancja fotosensybilizatora i ICG przy 808 nm.
Pomiary AFM przeprowadzono w warunkach ciekłych w trybie skanowania w systemie Bruker Dimension Icon AFM.Stosując otwartą strukturę z płynnymi komórkami, komórki przemyto dwukrotnie etanolem i osuszono strumieniem azotu.Włóż wysuszone komórki do głowicy optycznej mikroskopu.Natychmiast umieść kroplę próbki w puli płynu i umieść ją na wsporniku za pomocą sterylnej plastikowej strzykawki jednorazowego użytku i sterylnej igły.Kolejna kropla jest umieszczana bezpośrednio na próbce, a po opuszczeniu głowicy optycznej dwie krople łączą się, tworząc menisk między próbką a zbiornikiem cieczy.Pomiary AFM prowadzono za pomocą azotkowego wspornika SCANASYST-FLUID w kształcie litery V (Bruker, twardość k = 0,7 Nm-1, f0 = 120–180 kHz).
Chromatogramy HPLC uzyskano w systemie Waters e2695 wyposażonym w kolumnę phoenix C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) przy użyciu detektora 2489 UV/Vis.Długość fali detektora to 650 nm.Fazami ruchomymi A i B były odpowiednio woda i metanol, a szybkość przepływu fazy ruchomej wynosiła 1,0 ml·min-1.Gradient (rozpuszczalnik B) był następujący: 100% od 0 do 4 minut, 100% do 50% od 5 do 30 minut i ponownie na 100% od 31 do 40 minut.Rudę rozpuszczono w mieszanym roztworze metanolu i wody (50/50, objętościowo) w stężeniu 50 μM.Objętość wtrysku wynosiła 20 μl.
Testy GPC rejestrowano na aparacie Thermo ULTIMATE 3000 wyposażonym w dwie kolumny PL aquagel-OH MIXED-H (2 x 300 x 7,5 mm, 8 µm) i detektor współczynnika załamania światła ERC RefratoMax520.Kolumnę GPC eluowano wodą przy szybkości przepływu 1 ml/min w temperaturze 30°C.NPs rudy rozpuszczono w roztworze PBS (pH = 7,4, 50 μM), objętość nastrzyku wynosiła 20 μl.
Fotoprądy mierzono w układzie elektrochemicznym (CHI-660B, Chiny).Odpowiedzi optoelektroniczne przy włączaniu i wyłączaniu lasera (808 nm, 0,5 W/cm2) mierzono odpowiednio przy napięciu 0,5 V w czarnej skrzynce.Zastosowano standardowe trójelektrodowe ogniwo z elektrodą z węgla szklistego w kształcie litery L (GCE) jako elektrodą pracującą, standardową elektrodą kalomelową (SCE) jako elektrodą odniesienia i platynowym dyskiem jako przeciwelektrodą.Jako elektrolit zastosowano 0,1 M roztwór Na2SO4.
Linię komórkową ludzkiego raka piersi MDA-MB-231 zakupiono od KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, Chiny, numer katalogowy: KG033).Komórki hodowano w monowarstwach w Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, wysoka glukoza) uzupełnionej roztworem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), penicyliny (100 µg/ml) i streptomycyny (100 µg/ml).Wszystkie komórki hodowano w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2.
Test MTT zastosowano do określenia cytotoksyczności RuDA i RuDA-NP w obecności i przy braku napromieniowania światłem, z Vc lub bez Vc (0,5 mM).Komórki rakowe MDA-MB-231 hodowano na 96-studzienkowych płytkach przy gęstości komórek około 1 x 105 komórek/ml/studzienkę i inkubowano przez 12 godzin w 37,0°C w atmosferze 5% CO2 i 95% powietrza.Do komórek dodano rozpuszczone w wodzie NP RuDA i RuDA.Po 12 godzinach inkubacji komórki poddano działaniu promieniowania laserowego 0,5 W cm-2 o długości fali 808 nm przez 10 minut (300 J cm-2), a następnie inkubowano w ciemności przez 24 godziny.Komórki następnie inkubowano z MTT (5 mg/ml) przez kolejne 5 godzin.Na koniec zmień pożywkę na DMSO (200 µl), aby rozpuścić powstałe fioletowe kryształy formazanu.Wartości OD mierzono za pomocą czytnika mikropłytek o długości fali 570/630 nm.Wartość IC50 dla każdej próbki obliczono przy użyciu oprogramowania SPSS z krzywych dawka-odpowiedź uzyskanych z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów.
Komórki MDA-MB-231 potraktowano RuDA i RuDA-NP w stężeniu 50 μM.Po 12 godzinach inkubacji komórki naświetlano laserem o długości fali 808 nm i mocy 0,5 W/cm2 przez 10 min (300 J/cm2).W grupie witaminy C (Vc) komórki przed naświetlaniem laserem traktowano 0,5 mM Vc.Komórki następnie inkubowano w ciemności przez dodatkowe 24 godziny, następnie barwiono kalceiną AM i jodkiem propidyny (20 μg/ml, 5 μl) przez 30 minut, a następnie przemywano PBS (10 μl, pH 7,4).obrazy barwionych komórek.
Czas publikacji: 23 września-2022
