Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Używana wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, wyrenderujemy stronę bez stylów i JavaScriptu.
Enzymatyczne metody znakowania zbliżeniowego oparte na aktywowanych estrach lub rodnikach fenoksy są szeroko stosowane do mapowania proteomów subkomórkowych i interaktorów białkowych w żywych komórkach.Jednak aktywowane estry są mniej reaktywne, co skutkuje szerokim promieniem znakowania, a rodniki fenoksy generowane przez traktowanie nadtlenkiem mogą zakłócać szlaki redoks.W tym miejscu opisujemy metodę fotoaktywacji zależnej od znakowania zbliżeniowego (PDPL) opracowaną przez genetyczne łączenie białka fotosensybilizatora miniSOG z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.Wyzwalany przez niebieskie światło i kontrolowany przez czas ekspozycji, wytwarzany jest tlen singletowy, a następnie uzyskuje się znakowanie reszt histydyny z rozdziałem przestrzennym za pomocą sondy anilinowej.Wykazujemy jego wysoką wierność poprzez mapowanie proteomu specyficzne dla organelli.Porównanie side-by-side PDPL z TurboID pokazuje bardziej szczegółowe i kompleksowe pokrycie proteomiczne PDPL.Następnie zastosowaliśmy PDPL do związanego z chorobą koaktywatora transkrypcji ligazy Parkin BRD4 i E3 i znaleźliśmy wcześniej nieznane interakcje.Na podstawie badań przesiewowych nadekspresji zidentyfikowano dwa nieznane substraty, Ssu72 i SNW1, dla choroby Parkin, której degradacja odbywa się za pośrednictwem szlaku ubikwitynacja-proteasom.
Dokładna charakterystyka sieci białkowych leży u podstaw wielu fundamentalnych procesów komórkowych.Dlatego bardzo dokładne mapowanie czasoprzestrzenne interakcji białek zapewni molekularną podstawę do rozszyfrowania ścieżek biologicznych, patologii choroby i zakłócania tych interakcji w celach terapeutycznych.W tym celu wysoce pożądane są metody zdolne do wykrywania oddziaływań czasowych w żywych komórkach lub tkankach.Spektrometria masowa oczyszczania powinowactwa (AP-MS) była historycznie stosowana do identyfikacji partnerów wiążących interesujących nas białek (POI).Wraz z rozwojem metod proteomiki ilościowej powstał Bioplex3.0, największa baza danych sieci białkowych oparta na AP-MS.Chociaż AP-MS jest bardzo silny, etapy lizy i rozcieńczania komórek w przepływie pracy są skłaniane w kierunku słabych i przejściowych interakcji wiązania i wprowadzają artefakty po lizie, takie jak pary fałszywych interakcji, które nie są podzielone na przedziały przed lizą.
Aby rozwiązać te problemy, opracowano nienaturalne aminokwasy (UAA) z grupami sieciującymi oraz platformy enzymatycznego znakowania w pobliżu (PL) (np. APEX i BioID)5.Chociaż metoda UAA została z powodzeniem zastosowana w wielu scenariuszach i dostarcza informacji na temat bezpośrednich klejów białkowych, nadal wymagana jest optymalizacja miejsca wprowadzenia UAA.Co ważniejsze, jest to metoda znakowania stechiometrycznego, w której brakuje katalitycznego odwrócenia zdarzeń znakowania.W przeciwieństwie do tego, enzymatyczne metody PL, takie jak metoda BioID, łączą skonstruowaną ligazę biotynową z POI7, która następnie aktywuje biotynę z wytworzeniem reaktywnego związku pośredniego estru biotynylo-AMP.W ten sposób enzym katalizuje i uwalnia aktywowaną „chmurę” biotyny, która znakuje proksymalne reszty lizyny.Jednak BioID wymaga więcej niż 12 godzin, aby uzyskać wystarczająco oznakowany sygnał, co wyklucza jego zastosowanie z rozdzielczością czasową.Wykorzystując ukierunkowaną ewolucję opartą na prezentacji drożdży, TurboID został zaprojektowany w oparciu o BioID, aby był bardziej wydajny, umożliwiając wydajne znakowanie biotyną w ciągu 10 minut, umożliwiając badanie bardziej dynamicznych procesów.Ponieważ TurboID jest wysoce aktywny, a poziomy endogennej biotyny są wystarczające do znakowania na niskim poziomie, znakowanie tła staje się potencjalnym problemem, gdy wymagane jest wysoce wzmocnione i czasowe znakowanie przez dodanie egzogennej biotyny.Ponadto aktywowane estry są słabo reaktywne (t1/2 ~5 min), co może prowadzić do dużego promienia znakowania, szczególnie po wysyceniu sąsiednich białek biotyną 5. W innym podejściu, fuzja genetyczna zmodyfikowanej peroksydazy askorbinianowej (tj. rodniki fenolowe i umożliwia znakowanie białek w ciągu jednej minuty.9,10 APEX jest szeroko stosowany do identyfikacji proteomów subkomórkowych, kompleksów białek błonowych i cytozolowych kompleksów białek sygnałowych.11,12 Jednak potrzeba wysokich stężeń nadtlenków może wpływać na białka lub szlaki procesy komórkowe.
W związku z tym nowa metoda zdolna do generowania bardziej reaktywnych form supresji znakowanego promienia z wysoką dokładnością przestrzenną i czasową bez znaczącego zakłócania szlaków komórkowych będzie ważnym dodatkiem do istniejących metod. Wśród reaktywnych form tlen singletowy zwrócił naszą uwagę ze względu na krótki czas życia i ograniczony promień dyfuzji (t1/2 < 0,6 µs w komórkach)13. Wśród reaktywnych form tlen singletowy zwrócił naszą uwagę ze względu na krótki czas życia i ograniczony promień dyfuzji (t1/2 < 0,6 µs w komórkach)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниза из-за. Spośród form aktywnych tlen singletowy zwrócił naszą uwagę ze względu na krótki czas życia i ograniczony promień dyfuzji (t1/2 < 0,6 µs w komórkach)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13。 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 < Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времение изизни и инфограни (изи1/2) Spośród form aktywnych tlen singletowy przyciąga uwagę ze względu na krótki czas życia i ograniczony promień dyfuzji (t1/2 < 0,6 μs w komórkach).Stwierdzono, że tlen singletowy losowo utlenia metioninę, tyrozynę, histydynę i tryptofan, czyniąc go polarnym 14,15 do przyłączania się do sond opartych na aminach lub tiolach16,17.Chociaż do znakowania RNA przedziału subkomórkowego stosowano tlen singletowy, strategie zmiany przeznaczenia endogennych markerów zbliżeniowych POI pozostają niezbadane.W tym miejscu przedstawiamy platformę zwaną znakowaniem zbliżeniowym zależnym od fotoaktywacji (PDPL), w której używamy niebieskiego światła do oświetlania punktów POI połączonych z fotosensybilizatorem miniSOG i wyzwalania generowania tlenu singletowego w celu utlenienia reszt proksymalnych, a następnie modyfikacji zawierających aminy w celu utlenienia sond chemicznych do pośrednie żywe komórki..Przetestowaliśmy grupę sond chemicznych, aby zmaksymalizować swoistość znacznika i zidentyfikowaliśmy miejsca modyfikacji przy użyciu otwartego przepływu pracy proteomiki.Porównanie side-by-side PDPL z TurboID pokazuje bardziej szczegółowe i kompleksowe pokrycie proteomiczne PDPL.Zastosowaliśmy to podejście do specyficznych dla organelli markerów proteomu subkomórkowego i ogólnej identyfikacji partnerów wiążących dla związanego z rakiem epigenetycznego białka regulacyjnego BRD4 i ligazy E3 Parkin związanej z chorobą Parkinsona, co potwierdziło zarówno znaną, jak i nieznaną sieć białek interakcje..Zdolność PDPL do rozpoznawania substratów E3 w dużych kompleksach białkowych reprezentuje sytuację, w której wymagane jest rozpoznanie pośrednich wiązań.In situ potwierdzono występowanie dwóch nieznanych substratów parkin, w których pośredniczy ubikwitynacja-proteasom.
Terapia fotodynamiczna (PDT)19 i inaktywacja laserowa wspomagana chromoforem (CALI)20, w których naświetlanie fotosensybilizatorami generuje tlen singletowy, może dezaktywować docelowe białka lub spowodować śmierć komórki.Ponieważ tlen singletowy jest substancją wysoce reaktywną z teoretyczną odległością dyfuzji około 70 nm, można kontrolować przestrzennie ograniczone utlenianie wokół fotosensybilizatora.W oparciu o tę koncepcję postanowiliśmy użyć tlenu singletowego, aby uzyskać ścisłe znakowanie kompleksów białkowych w żywych komórkach.Opracowaliśmy podejście chemoproteomiczne PDPL, aby spełnić cztery funkcje: (1) katalizować wytwarzanie aktywnego tlenu singletowego, podobnie jak podejście enzymatyczne PL;(2) zapewniają znakowanie z rozdzielczością czasową po inicjacji światła;(3) przez zmianę (4) Unikaj stosowania kofaktorów endogennych (takich jak biotyna) w celu zmniejszenia tła lub stosuj wysoce zakłócające odczynniki egzogenne (takie jak nadtlenki), aby zminimalizować narażenie komórek na stres środowiskowy.
Fotosensybilizatory można podzielić na dwie kategorie, w tym fluorofory o małej masie cząsteczkowej (np. róż bengalski, błękit metylenowy)22 oraz genetycznie kodowane małe białka (np. miniSOG, KillerRed)23.Aby osiągnąć modułową konstrukcję, opracowaliśmy platformę PDPL pierwszej generacji, dodając białka fotouczulacza (PS) do POI24,25 (Rysunek 1a).Po napromieniowaniu światłem niebieskim, tlen singletowy utlenia proksymalne nukleofilowe reszty aminokwasowe, co skutkuje polaryzacją płuc, która jest elektrofilowa i może dalej reagować z nukleofilami sondy aminowej16,17.Sonda została zaprojektowana z alkinowym uchwytem, aby umożliwić chemię kliknięcia i pociągnąć w dół do charakteryzacji LC/MS/MS.
Schematyczna ilustracja znakowania kompleksów białkowych za pośrednictwem miniSOG.Pod wpływem światła niebieskiego komórki eksprymujące miniSOG-POI wytwarzają tlen singletowy, który modyfikuje białka oddziałujące, ale nie białka niewiążące.Produkty pośrednie fotooksydacji są przechwytywane przez znaczniki przekaźnikowe sondy aminowej, tworząc addukty kowalencyjne.Grupa alkinylowa na sondzie chemicznej umożliwia chemię typu click w celu wzbogacenia przez obniżenie, a następnie oznaczenie ilościowe LC-MS/MS.b Struktura chemiczna sond aminowych 1-4.c Reprezentatywna fluorescencyjna analiza żelowa mitochondrialnych zlokalizowanych markerów proteomicznych za pośrednictwem miniSOG przy użyciu sond 1-4 i względna ocena ilościowa oparta na densytometrii żelowej.Stosunek sygnału do tła sond chemicznych oceniano stosując eksperymenty z kontrolą negatywną z wyłączeniem światła niebieskiego lub stosując komórki HEK293T bez ekspresji miniSOG.n = 2 biologicznie niezależne próbki.Każda kropka reprezentuje replikę biologiczną.d Reprezentatywne wykrywanie i oznaczanie ilościowe PDPL przy użyciu zoptymalizowanej sondy 3 w obecności lub nieobecności wskazanych składników PDPL, takich jak c.n = 3 biologicznie niezależne próbki.Każda kropka reprezentuje replikę biologiczną.Linie środkowe i wąsy przedstawiają średnią i ± odchylenie standardowe.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Obrazowanie konfokalne tlenu singletowego za pomocą barwnika Si-DMA w dalekiej czerwieni.Skala: 10 µm.Eksperymenty z obrazowaniem na żelu i konfokalne zostały niezależnie powtórzone co najmniej dwa razy z podobnymi wynikami.
Najpierw przetestowaliśmy zdolność dojrzałych fotosensybilizatorów miniSOG26 i KillerRed23, stabilnie wyrażanych w HEK293T, do pośredniczenia w znakowaniu proteomu propargilaminą jako sondy chemicznej (ryc. uzupełniająca 1a).Analiza fluorescencji żelu wykazała, że znakowanie całego proteomu osiągnięto przy użyciu miniSOG i napromieniowania światłem niebieskim, podczas gdy nie zaobserwowano widocznego produktu znakującego przy użyciu KillerRed.Aby poprawić stosunek sygnału do tła, przetestowaliśmy zestaw sond chemicznych zawierających anilinę (1 i 3), propyloaminę (2) lub benzyloaminę (4).Zaobserwowaliśmy, że same komórki HEK293T miały wyższy sygnał tła w porównaniu do braku światła niebieskiego, prawdopodobnie z powodu endogennego fotouczulacza ryboflawiny, mononukleotydu flawiny (FMN) 27 . Sondy chemiczne 1 i 3 na bazie aniliny dały lepszą specyficzność, przy czym HEK293T stabilnie eksprymował miniSOG w mitochondriach, wykazując >8-krotny wzrost sygnału dla sondy 3, podczas gdy sonda 2 stosowana w metodzie znakowania RNA CAP-seq wykazała tylko ~2,5- krotny wzrost sygnału, prawdopodobnie z powodu różnych preferencji reaktywności między RNA i białkiem (ryc. 1b, c). Sondy chemiczne 1 i 3 na bazie aniliny dały lepszą specyficzność, przy czym HEK293T stabilnie eksprymował miniSOG w mitochondriach, wykazując >8-krotny wzrost sygnału dla sondy 3, podczas gdy sonda 2 stosowana w metodzie znakowania RNA CAP-seq wykazała tylko ~2,5- krotny wzrost sygnału, prawdopodobnie z powodu różnych preferencji reaktywności między RNA i białkiem (ryc. 1b, c).Sondy chemiczne 1 i 3 na bazie aniliny wykazały lepszą specyficzność: HEK293T, który stabilnie wyraża miniSOG w mitochondriach, wykazuje ponad 8-krotny wzrost sygnału dla sondy 3, podczas gdy sonda 2, stosowana tylko w metodzie znakowania CAP-seq RNA, pokazuje ~2,5-krotny wzrost sygnału, prawdopodobnie z powodu różnych preferencji reaktywności między RNA i białkiem (ryc. 1b, c).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-sekw 的探针2 仅显示~ 2,5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAOparte na anilinie sondy chemiczne 1 i 3 miały lepszą specyficzność, HEK293T stabilnie wyrażał miniSOG w mitochondriach, a sonda 3 miała ponad 8-krotny wzrost sygnału, podczas gdy sonda 2 dla metody znakowania CAP-seq RNA wykazała tylko ~2,5-krotny wzrost.w sygnale, prawdopodobnie ze względu na różne preferencje reakcji między RNA a białkiem (ryc. 1b, c).Dodatkowo przetestowano izomery sondy 3 i sondy hydrazyny (sondy 5, 6, 7) potwierdzając optymalizację sondy 3 (rysunek uzupełniający 1b,c).Podobnie, analiza fluorescencji w żelu ujawniła inne zoptymalizowane parametry eksperymentalne: długość fali napromieniania (460 nm), stężenie sondy chemicznej (1 mM) i czas naświetlania (20 min) (rysunek uzupełniający 2a–c).Pominięcie jakiegokolwiek komponentu lub kroku w protokole PDPL spowodowało znaczące odwrócenie sygnału do tła (rys. 1d).Warto zauważyć, że znakowanie białek zostało znacznie zmniejszone w obecności azydku sodu lub troloxu, o których wiadomo, że tłumią tlen singletowy.Obecność D2O, o którym wiadomo, że stabilizuje tlen singletowy, wzmacnia sygnał znakujący.Aby zbadać udział innych reaktywnych form tlenu w znakowaniu, dodano mannitol i witaminę C, aby ustalić, odpowiednio, zmiatacze rodników hydroksylowych i ponadtlenkowych, 18, 29, ale nie stwierdzono, aby zmniejszały one znakowanie.Dodanie H2O2, ale nie oświetlenie, nie spowodowało oznakowania (rysunek uzupełniający 3a).Obrazowanie fluorescencyjne singletowego tlenu za pomocą sond Si-DMA potwierdziło obecność tlenu singletowego w przewodzie HEK293T-miniSOG, ale nie w oryginalnym przewodzie HEK293T.Ponadto mitoSOX Red nie mógł wykryć wytwarzania ponadtlenku po naświetleniu (ryc. 1e i uzupełniający ryc. 3b) 30. Dane te silnie sugerują, że tlen singletowy jest główną reaktywną formą tlenu odpowiedzialną za późniejsze znakowanie proteomiczne.Oceniono cytotoksyczność PDPL, w tym napromieniowanie światłem niebieskim i sondami chemicznymi, i nie zaobserwowano znaczącej cytotoksyczności (ryc. uzupełniająca 4a).
Aby zbadać mechanizm znakowania i umożliwić identyfikację proteomiczną kompleksów białkowych za pomocą LC-MS/MS, najpierw musimy określić, które aminokwasy są modyfikowane oraz masę delta znaczników sondy.Doniesiono, że metionina, histydyna, tryptofan i tyrozyna są modyfikowane przez tlen singletowy14,15.Integrujemy przepływ pracy TOP-ABPP31 z bezstronnym otwartym wyszukiwaniem zapewnianym przez platformę obliczeniową FragPipe opartą na MSFragger32.Po modyfikacji tlenu singletowego i znakowaniu sondy chemicznej przeprowadzono chemię typu click przy użyciu znacznika redukcji biotyny zawierającej rozszczepialny łącznik, a następnie rozciąganie neutrawidyną i trawienie trypsyną.Zmodyfikowany peptyd, wciąż związany z żywicą, został poddany fotorozszczepieniu do analizy LC-MS/MS (Figura 2a i dane uzupełniające 1).Duża liczba modyfikacji wystąpiła w całym proteomie z wymienionymi ponad 50 dopasowaniami mapy peptydowej (PSM) (ryc. 2b).Co zaskakujące, zaobserwowaliśmy tylko modyfikację histydyny, prawdopodobnie z powodu większej reaktywności utlenionej histydyny w stosunku do sond anilinowych niż inne aminokwasy.Zgodnie z opublikowanym mechanizmem utleniania histydyny przez tlen singletowy21,33 proponowana struktura delta masy +229 Da odpowiada adduktowi sondy 3 z 2-okso-histydyną po dwóch oksydacjach, podczas gdy +247 Da jest produktem hydrolizy +229 Da (rysunek uzupełniający 5).Ocena widma MS2 wykazała wysoką wiarygodność identyfikacji większości jonów y i b, w tym identyfikację zmodyfikowanych jonów fragmentacyjnych (y i b) (rys. 2c).Analiza kontekstu lokalnej sekwencji histydyn zmodyfikowanych PDPL ujawniła umiarkowaną preferencję motywu dla małych reszt hydrofobowych w pozycjach ±1 (rysunek uzupełniający 4b).Średnio na białko zidentyfikowano 1,4 histydyny, a miejsca tych markerów określono za pomocą analizy pola powierzchni dostępnego dla rozpuszczalnika (SASA) i względnej dostępności rozpuszczalnika (RSA) (rysunek uzupełniający 4c, d).
Bezstronny przepływ pracy do badania selektywności resztkowej za pomocą platformy obliczeniowej FragPipe obsługiwanej przez MSFragger.Rozszczepialne łączniki są stosowane w chemii Click, aby umożliwić fotorozszczepienie zmodyfikowanych peptydów z żywicy streptawidyny.Rozpoczęto otwarte wyszukiwanie w celu zidentyfikowania licznych modyfikacji, a także odpowiednich pozostałości.b Przypisz masę modyfikacji zachodzących w proteomie.Mapowanie peptydów PSM.c Adnotacja spektralna MS2 miejsc histydynowych zmodyfikowanych sondą 3. Jako reprezentatywny przykład, reakcja kowalencyjna z sondą 3 dodała +229,0938 Da do zmodyfikowanego aminokwasu.d Test mutacji stosowany do testowania markerów PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) i PRDX1 (H10A, H81A, H169A) transfekowano plazmidami typu dzikiego do wykrywania anty-Flag.e Syntetyczny peptyd poddano reakcji z oczyszczonym miniSOG w obecności sondy 3 iw widmie LC-MS odnotowano odpowiednie produkty o Δm +247 i +229.f Interakcje białko-białko in vitro modelowane za pomocą znacznika miniSOG-6xHis i przeciwciała anty-6xHis.Analiza antybiotyny (streptawidyna-HRP) i anty-mysiego Western blot kompleksów przeciwciał miniSOG-6xHis/anty-6xHis znakowanych sondą 3, w zależności od czasu ekspozycji na światło.Znaczniki dla poszczególnych białek są wyrażane w odpowiedniej masie cząsteczkowej: łańcuch lekki przeciwciała LC, łańcuch ciężki przeciwciała HC.Eksperymenty te zostały niezależnie powtórzone co najmniej dwa razy z podobnymi wynikami.
W celu weryfikacji biochemicznej miejsca znakowania, PRDX3 i PRDX1 zidentyfikowane za pomocą spektrometrii masowej zmieniono z histydyny na alaninę i porównano z typem dzikim w testach transfekcji.Wyniki PDPL wykazały, że mutacja znacząco zmniejszyła znakowanie (ryc. 2d).Tymczasem sekwencje peptydowe zidentyfikowane w otwartym wyszukiwaniu zostały zsyntetyzowane i poddane reakcji in vitro z oczyszczonym miniSOG w obecności sondy 3 i niebieskiego światła, dając produkty o przesunięciu masy +247 i +229 Da przy wykryciu metodą LC-MS (Fig. 2e).).Aby sprawdzić, czy oddziałujące ze sobą białka proksymalne mogą być znakowane in vitro w odpowiedzi na fotoaktywację miniSOG, zaprojektowaliśmy sztuczny test bliskości poprzez interakcję między białkiem miniSOG-6xHis a przeciwciałem monoklonalnym anty-His in vitro (Figura 2f).W tym teście oczekiwaliśmy proksymalnego znakowania łańcuchów ciężkich i lekkich przeciwciała miniSOG.W rzeczywistości, Western blot anty-mysi (rozpoznający ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciała znakowanego anty-6xHis) i streptawidyną wykazał silną biotynylację łańcuchów ciężkich i lekkich.W szczególności zauważyliśmy autobiotynylację miniSOG ze względu na znacznik 6xHis i wiązania krzyżowe między łańcuchami lekkimi i ciężkimi, co może być związane z wcześniej opisaną przerwą między proksymalną odpowiedzią lizyny i 2-okso-histydyny.Podsumowując, dochodzimy do wniosku, że PDPL modyfikuje histydynę w sposób zależny od bliskości.
Naszym kolejnym celem było scharakteryzowanie proteomu subkomórkowego w celu przetestowania specyficzności znakowania in situ.Dlatego stabilnie wyrażaliśmy miniSOG w jądrze, macierzy mitochondrialnej lub zewnętrznej błonie ER komórek HEK293T (ryc. 3a).Analiza fluorescencji żelu ujawniła liczne znakowane prążki w trzech lokalizacjach subkomórkowych, a także różne wzory znakowania (ryc. 3b).Analiza obrazowania fluorescencyjnego wykazała wysoką specyficzność PDPL (ryc. 3c).Po przepływie pracy PDPL następowały reakcje typu click z barwnikami rodaminowymi w celu wyznaczenia proteomów subkomórkowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a sygnały PDPL były kolokalizowane z DAPI, trackerami mitochondrialnymi lub trackerami ER, potwierdzając wysoką wierność PDPL.Dla trzech lokalizacji organelli, porównanie side-by-side PDPL z TurboID przy użyciu western blot awidyny wykazało, że PDPL była znakowana bardziej specyficznie w porównaniu z ich odpowiednimi kontrolami.W warunkach PDPL pojawiło się więcej znakowanych prążków, co wskazuje na więcej znakowanych PDPL białek (rysunek uzupełniający 6a-d).
a Schematyczne przedstawienie znakowania proteomu specyficznego dla organelli za pośrednictwem miniSOG.miniSOG celuje w macierz mitochondrialną poprzez fuzję z N-końcowymi 23 aminokwasami ludzkiej COX4 (mito-miniSOG), jądro poprzez fuzję z H2B (jądro-miniSOG) i Sec61β przez cytoplazmatyczną stronę błony ER (ER-miniSOG ).Wskazania obejmują obrazowanie żelowe, obrazowanie konfokalne i spektrometrię mas.b Reprezentatywne obrazy żelu trzech profili PDPL specyficznych dla organelli.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Reprezentatywne obrazy konfokalne komórek HEK293T stabilnie eksprymujących miniSOG z różnymi lokalizacjami subkomórkowymi wykrytymi przez przeciwciało znakowane V5 (czerwony).Markery subkomórkowe są używane dla mitochondriów i ER (zielony).Przepływ pracy PDPL obejmuje wykrywanie proteomów subkomórkowych znakowanych miniSOG (żółty) przy użyciu chemii kliknięć azydku Cy3.Skala: 10 µm.d Wykresy wulkaniczne proteomów znakowanych PDPL w różnych organellach określone ilościowo za pomocą nieznakowanej oceny ilościowej (n = 3 niezależne eksperymenty biologiczne).Na wykresach wulkanicznych zastosowano dwustronny test t Studenta.HEK293T typu dzikiego zastosowano jako kontrolę negatywną. Znacznie zmienione białka zaznaczono na czerwono (p < 0,05 i >2-krotna różnica intensywności jonów). Znacznie zmienione białka zaznaczono na czerwono (p < 0,05 i >2-krotna różnica intensywności jonów). наительный измененный biały biały красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Znacznie zmienione białka zaznaczono na czerwono (p < 0,05 i >2-krotna różnica w intensywności jonów).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 наительный измененный biały biały красным цветом (p < 0,05 и > 2-kratnaja разница в ионной силе). Znacznie zmienione białka zaznaczono na czerwono (p < 0,05 i > 2-krotna różnica siły jonowej).Pokrewne białka ważne dla HEK293T-miniSOG, ale nieistotne dla HEK293T, pokazano na zielono.e Analiza specyficzności zbiorów danych proteomicznych z eksperymentówCałkowita liczba statystycznie istotnych białek w każdej organelli (czerwone i zielone kropki) jest zaznaczona na górze.Histogramy pokazują białka zlokalizowane w organellach na podstawie MitoCarta 3.0, analizy GO oraz A. Ting et al.ludzie.Oddzielne zestawy danych dla mitochondriów, jąder i ER.Eksperymenty te zostały niezależnie powtórzone co najmniej dwa razy z podobnymi wynikami.Surowe dane są dostarczane w postaci surowych plików danych.
Zachęcony wynikami żelu i obrazowania, do określenia ilościowego zidentyfikowanego proteomu w każdym organelli zastosowano oznaczenie ilościowe bez znacznika (dane uzupełniające 2).Nietransfekowany HEK293T zastosowano jako kontrolę negatywną do odejmowania markerów tła. Analiza wykresu wulkanu wykazała znacząco wzbogacone białka (p < 0,05 i >2-krotna intensywność jonów), a także białka singletonowe obecne tylko w liniach z ekspresją miniSOG (ryc. 3d czerwone i zielone kropki). Analiza wykresu wulkanu wykazała znacząco wzbogacone białka (p < 0,05 i >2-krotna intensywność jonów), a także białka singletonowe obecne tylko w liniach z ekspresją miniSOG (ryc. 3d czerwone i zielone kropki). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Analiza wykresów wulkanicznych wykazała znacząco wzbogacone białka (p<0,05 i >2-krotna intensywność jonów), a także pojedyncze białka obecne tylko w liniach z ekspresją miniSOG (ryc. 3d, czerwone i zielone kropki).火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0,05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中的单一蛋白质（图3d 红色和绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 （图 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Analiza wykresu wulkanu ujawniła znacząco wzbogacone białka (p<0,05 i >2x siła jonowa), a także pojedyncze białka obecne tylko w linii ekspresyjnej miniSOG (czerwone i zielone kropki na ryc. 3d).Łącząc te dane, zidentyfikowaliśmy odpowiednio 1364, 461 i 911 statystycznie istotnych białek błony zewnętrznej jądrowej, mitochondrialnej i ER.Aby przeanalizować dokładność PDPL zlokalizowanej w organelli, wykorzystaliśmy MitoCarta 3.0, analizę Gene Ontology (GO) oraz A. Ting et al.zestaw danych8 zastosowano dla mitochondriów, jądra komórkowego i ER, aby przetestować specyficzność organelli wykrytych białek, co odpowiada dokładności 73,4, 78,5 i 73,0% (ryc. 3e).Specyficzność PDPL potwierdza, że PDPL jest idealnym narzędziem do identyfikacji proteomów specyficznych dla organelli.Warto zauważyć, że analiza submitochondrialna zidentyfikowanych białek mitochondrialnych wykazała, że uwięziony proteom był głównie rozmieszczony w macierzy i błonie wewnętrznej (odpowiednio 226 i 106), co stanowi 91,7% (362) całkowitej liczby zidentyfikowanych białek mitochondrialnych.dodatkowo potwierdzono wysoki poziom PDPL (rysunek uzupełniający 7a).Podobnie analiza podjądrowa wykazała, że przechwycony proteom był głównie rozmieszczany w jądrze, nukleoplazmie i jąderku (ryc. uzupełniający 7b).Jądrowa analiza proteomiczna z peptydem sygnałowym lokalizacji jądrowej (3xNLS) wykazała podobną dokładność do konstruktu H2B (rysunek uzupełniający 7c-h).W celu określenia swoistości markera PDPL wybrano jądrową lamininę A jako bardziej dyskretnie zlokalizowaną pułapkę POI7.PDPL zidentyfikowało 36 istotnie wzbogaconych białek, z których 12 białek (30,0%, w tym lamina A) było dobrze scharakteryzowanymi białkami oddziałującymi z laminą A, opisanymi w bazie danych String, z wyższym odsetkiem niż metoda BioID (122 białka) 28 z 28., 22,9 %) 7. Nasza metoda zidentyfikowała mniej białek, prawdopodobnie ze względu na ograniczone obszary znakowania, co było możliwe dzięki bardziej aktywnemu tlenowi singletowemu.Analiza GO wykazała, że zidentyfikowane białka były zlokalizowane głównie w nukleoplazmie (26), błonie jądrowej (10), błonie jądrowej (9) i porach jądrowych (5).Łącznie te zlokalizowane w jądrze białka stanowiły 80% wzbogaconych białek, co dodatkowo demonstruje specyficzność PDPL (rysunek uzupełniający 8a-d).
Po ustaleniu zdolności PDPL do wykonywania znakowania bliskości w organellach, przetestowaliśmy następnie, czy PDPL można wykorzystać do analizy partnerów wiążących POI.W szczególności staraliśmy się zdefiniować analizę PDPL białek cytozolowych, które są uważane za trudniejsze cele niż ich odpowiedniki zlokalizowane w błonie ze względu na ich wysoce dynamiczny charakter.Bromodomena i białko pozaterminowe (BET) BRD4 przyciągnęły naszą uwagę ze względu na jego kluczową rolę w różnych chorobach35,36.Kompleks utworzony przez BRD4 jest koaktywatorem transkrypcji i ważnym celem terapeutycznym.Uważa się, że dzięki regulacji ekspresji czynników transkrypcyjnych c-myc i Wnt5a BRD4 jest kluczowym czynnikiem wpływającym na ostrą białaczkę szpikową (AML), szpiczaka mnogiego, chłoniaka Burkitta, raka okrężnicy i chorób zapalnych37,38.Ponadto niektóre wirusy celują w BRD4 w celu regulacji transkrypcji wirusowej i komórkowej, takie jak wirus brodawczaka, HIV i SARS-CoV-236,39.
Aby zmapować oddziaływanie BRD4 za pomocą PDPL, połączyliśmy miniSOG z krótką N- lub C-końcową izoformą BRD4.Wyniki proteomiczne ujawniły wysoki stopień nakładania się dwóch konstruktów (rysunek uzupełniający 9a).Proteom jądrowy zidentyfikowany za pomocą miniSOG-H2B obejmuje 77,6% białek oddziałujących z BRD4 (rysunek uzupełniający 9b).Następnie zastosowano różne czasy świecenia (2, 5, 10, 20 min) do regulacji promienia znacznika (ryc. 4a i dane uzupełniające 3).Wnioskujemy, że przy krótszych fotoperiodach PDPL będzie przede wszystkim znakować bezpośrednich partnerów wiążących, podczas gdy dłuższe okresy będą obejmować białka zidentyfikowane podczas krótszych okresów fotoaktywacji, a także pośrednie cele w znakujących kompleksach.W rzeczywistości stwierdziliśmy silne nakładanie się sąsiednich punktów czasowych (84,6% dla 2 i 5 min; 87,7% dla 5 i 10 min; 98,7% dla 10 i 20 min) (ryc. 4b i uzupełniający ryc. 9c).We wszystkich grupach eksperymentalnych znaleźliśmy nie tylko samooznakowanie BRD4, ale kilka znanych celów, takich jak MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A i HMGB1 z adnotacjami w bazie danych ciągów.Siła jonowa tych celów jest proporcjonalna do czasu ekspozycji (rys. 4c i rys. uzupełniający 9d).Analiza GO białek zidentyfikowanych w grupie 2-minutowej wykazała, że zidentyfikowane białka były zlokalizowane w jądrze i były zaangażowane w przebudowę chromatyny i funkcję polimerazy RNA.Molekularna funkcja białka została wzbogacona o wiązanie chromatyny lub koaktywację transkrypcji, zgodnie z funkcją BRD4 (ryc. 4d).Analiza interakcji białek w oparciu o bazę danych wykazała pierwszy poziom pośrednich interakcji między kompleksami oddziałującymi z rodziny BRD4 i HDAC, takimi jak SIN3A, NCOR2, BCOR i SAP130 (ryc. 4e i uzupełniający ryc. 9e), zgodny z acetylowanymi histonami wiążącymi BRD4 i HDAC ..Ponadto reprezentatywne cele zidentyfikowane przez LC-MS/MS, w tym Sin3A, NSUN2, Fus i SFPQ, potwierdzono metodą Western blot (Fig. 4f).Ostatnio doniesiono, że krótka izoforma BRD4 tworzy jądra o właściwościach rozdziału faz ciecz-ciecz (LLPS).Białka wiążące RNA Fus i SFPQ pośredniczą w LLPS różnych procesów komórkowych i zostały tu zidentyfikowane jako niezarejestrowane białka wiążące BRD4.Interakcja między BRD4 i SFPQ została potwierdzona eksperymentami koimmunoprecypitacji (co-IP) (Figura 4g), co sugeruje inny mechanizm rozdzielania faz ciecz-ciecz za pośrednictwem BRD4, zasługujący na dalsze badania.Podsumowując, wyniki te sugerują, że PDPL jest idealną platformą do identyfikacji znanych białek wchodzących w interakcje z BRD4, jak również nieznanych białek wiążących.
a Schematyczne przedstawienie oznaczenia zbliżeniowego BRD4 za pośrednictwem miniSOG, czasy ekspozycji: 2, 5, 10 i 20 min.b Nakładanie się białek zidentyfikowanych w różnych czasach naświetlania.Wzbogacenie białka zidentyfikowane w HEK293T-miniSOG-BRD4 było statystycznie istotne w porównaniu z HEK293T typu dzikiego.c Intensywność jonów podczas oznaczania ilościowego niewyznakowanych reprezentatywnych znanych białek wiążących BRD4 w określonym czasie ekspozycji.n = 3 biologicznie niezależne próbki.Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe.d Analiza ontologiczna genów (GO) białek zidentyfikowanych w grupie 2-minutowej.Wymienionych jest pierwszych dziesięć terminów GO.Bąbelki są zabarwione zgodnie z kategorią terminu GO, a wielkość bąbelków jest proporcjonalna do liczby białek znalezionych w każdym z terminów.e Analiza łańcuchowa białek oddziałujących z BRD4.Żółte kółka to klej bezpośredni, a szare to pierwsza warstwa kleju pośredniego.Czerwone linie reprezentują interakcje określone eksperymentalnie, a niebieskie linie reprezentują przewidywane interakcje.f Reprezentatywne cele wiążące BRD4 zidentyfikowane w LC-MS/MS zweryfikowano metodą Western blot.g Doświadczenia z koimmunoprecypitacją potwierdzają interakcję między SFPQ i BRD4.Eksperymenty te zostały niezależnie powtórzone co najmniej dwa razy z podobnymi wynikami.Surowe dane są dostarczane w postaci surowych plików danych.
Oprócz identyfikacji niezarejestrowanych celów związanych z POI, stawiamy hipotezę, że PDPL będzie odpowiedni do identyfikacji substratów dla enzymów, co wymagałoby scharakteryzowania pośrednich białek wiążących w dużych kompleksach w celu opisania niezarejestrowanych substratów.Parkin (kodowany przez PARK2) jest ligazą E3 i wiadomo, że mutacje w parkinie powodują autosomalną recesywną młodzieńczą chorobę Parkinsona (AR-JP)42.Ponadto parkin został opisany jako niezbędny dla mitofagii (autofagii mitochondrialnej) i usuwania reaktywnych form tlenu.Jednak chociaż zidentyfikowano kilka substratów parkinowych, rola parkin w tej chorobie pozostaje niejasna.Aby opisać swoje niescharakteryzowane substraty, PDPL przetestowano, dodając miniSOG do N- lub C-końca parkin.Komórki potraktowano transporterem protonów karbonylocyjanku m-chlorofenylohydrazonem (CCCP), aby aktywować parkin poprzez szlak PINK1-Parkin.W porównaniu z naszymi wynikami BRD4 PDPL, fuzja N-końca parkiny ujawniła większy zestaw białek docelowych, chociaż obejmowała większą część C-końca (177 z 210) (Figura 5a, b i dane uzupełniające 4).wynik jest zgodny z doniesieniami, że N-końcowe znaczniki mogą nieprawidłowo aktywować Parkin44.Co zaskakujące, w naszych danych było tylko 18 nakładających się białek z opublikowanymi wynikami AP-MS dla Parkin43, prawdopodobnie z powodu różnic między liniami komórkowymi i przepływami pracy proteomicznej.Oprócz czterech znanych białek (ARDM1, HSPA8, PSMD14 i PSMC3) zidentyfikowanych dwoma metodami (ryc. 5c)43.W celu dalszej walidacji wyników LC-MS/MS, traktowanie PDPL, a następnie Western blot zastosowano do porównania wyników testu komórek macierzystych HEK293T i stabilnej N-końcowej linii parkin.Wcześniej nieznane cele CDK2, DUT, CTBP1 i PSMC4 zostały przetestowane przy użyciu znanego środka wiążącego, DNAJB1 (ryc. 5d).
Wykres wulkaniczny białek oddziałujących z parkinami w komórkach HEK293T ze stabilnie eksprymowanym miniSOG połączonym z N- lub C-końcem parkiny (n = 3 niezależne eksperymenty biologiczne).Na wykresach wulkanicznych zastosowano dwustronny test t Studenta.HEK293T zastosowano jako kontrolę negatywną. Znacznie zmienione białka zaznaczono na czerwono (p < 0,05 i >2-krotna różnica intensywności jonów). Znacznie zmienione białka zaznaczono na czerwono (p < 0,05 i >2-krotna różnica intensywności jonów). наительный измененный biały biały красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Znacznie zmienione białka zaznaczono na czerwono (p < 0,05 i >2-krotna różnica w intensywności jonów).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 наительный измененный biały biały красным цветом (p < 0,05 и > 2-kratnaja разница в ионной силе). Znacznie zmienione białka zaznaczono na czerwono (p < 0,05 i > 2-krotna różnica siły jonowej).Pokrewne białka ważne dla HEK293T-miniSOG, ale nieistotne dla HEK293T, pokazano na zielono.b Diagram Venna przedstawiający nakładające się białka między konstruktami N-końcowymi i C-końcowymi.Znaczniki N-końcowe mogą nieprawidłowo aktywować parkinę i skutkować bardziej rozpoznawalnymi białkami.c Diagram Venna przedstawiający nakładające się białka między PDPL i AP-MS.Wymieniono znane interakcje, w tym 4 z 18 nakładających się białek i 11 ze 159 białek zidentyfikowanych specyficznie w PDPL.d Reprezentatywne cele zidentyfikowane przez LC-MS/MS zweryfikowano metodą Western blot.e Ssu72 i SNW1 zidentyfikowano jako niezarejestrowane substraty parkin.Te znakowane FLAG plazmidy białkowe transfekowano do HEK293T i HEK293T-Parkin-miniSOG, a następnie traktowano CCCP w różnych punktach czasowych.Degradacja była bardziej wyraźna w linii nadekspresji Parkina.f Stosując inhibitor proteasomu MG132 potwierdzono, że w procesie degradacji Ssu72 i SNW1 pośredniczy ubikwitynacja proteasomu.Eksperymenty te zostały niezależnie powtórzone co najmniej dwa razy z podobnymi wynikami.Surowe dane są dostarczane w postaci surowych plików danych.
Warto zauważyć, że białka zidentyfikowane przez PDPL muszą zawierać białka wiążące parkinę i ich substraty.Aby wykryć niezarejestrowane substraty parkin, wybraliśmy siedem zidentyfikowanych białek (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 i SNW1) i transfekowane plazmidy w celu ekspozycji tych genów na normalny HEK293T i stabilną ekspresję HEK293T miniSOG-Parkina, a następnie traktowanie CCCP.Poziomy białek Ssu72 i SNW1 uległy znacznemu obniżeniu w stabilnej linii miniSOG-Parkin (ryc. 5e).Obróbka CCCP przez 12 godzin spowodowała najbardziej znaczącą degradację obu podłoży.Aby zbadać, czy degradacja Ssu72 i SNW1 jest regulowana przez ubikwitynację proteasomu, dodano inhibitor proteasomu MG132 w celu zahamowania aktywności proteasomu i faktycznie stwierdziliśmy, że proces ich degradacji został zahamowany (Fig. 5f).Dodatkowe cele niebędące substratami potwierdzono jako elementy oddziałujące z Parkin przy użyciu Western blot (ryc. uzupełniająca 10), które wykazały spójne wyniki z LC-MS/MS.Podsumowując, integracja przepływu pracy PDPL z weryfikacją transfekcji białka docelowego umożliwia identyfikację niezarejestrowanych substratów ligazy E3.
Opracowaliśmy wspólną platformę do oznaczania odległości, która pozwala na identyfikację w czasie i przestrzeni punktów POI wchodzących w interakcje.Platforma oparta jest na białku fotosensybilizatora miniSOG, które ma tylko około 12 kDa, mniej niż połowę wielkości dojrzałego enzymu APEX2 (27 kDa) i jedną trzecią wielkości TurboID (35 kDa).Mniejszy rozmiar powinien znacznie rozszerzyć zakres zastosowań do badania interakcji małych białek.Potrzebne są dalsze badania nad dodatkowymi fotosensybilizatorami, czy to genetycznie kodowanymi białkami, czy małymi cząsteczkami, aby zwiększyć wydajność kwantową tlenu singletowego i zwiększyć czułość tego podejścia.W obecnej wersji miniSOG wysoką rozdzielczość czasową można osiągnąć za pomocą niebieskiego podświetlenia do aktywacji znaczników zbliżeniowych.Ponadto, dłuższy czas ekspozycji uwalniał większą „chmurę” tlenu singletowego, co skutkowało modyfikacją bardziej dystalnych reszt histydyny, zwiększonym promieniem znakowania i możliwością precyzyjnego dostrojenia rozdzielczości przestrzennej PDPL.Przetestowaliśmy również siedem sond chemicznych, aby zwiększyć stosunek sygnału do tła i zbadaliśmy mechanizm molekularny stojący za tym podejściem.Przepływ pracy TOP-ABPP w połączeniu z bezstronnym otwartym wyszukiwaniem potwierdził, że modyfikacje wystąpiły tylko w histydynach i nie zaobserwowano spójnego mikrośrodowiska dla zwiększonych modyfikacji histydyn, z wyjątkiem umiarkowanej preferencji dla histydyn w regionie pętli.
PDPL została również wykorzystana do scharakteryzowania proteomów subkomórkowych ze specyficznością proteomu i pokryciem co najmniej porównywalnym z innymi metodami znakowania zbliżeniowego i sondami chemicznymi specyficznymi dla organelli.Markery zbliżeniowe zostały również z powodzeniem wykorzystane do scharakteryzowania proteomów powierzchniowych, lizosomalnych i związanych z wydzielinami46,47.Wierzymy, że PDPL będzie kompatybilne z tymi organellami subkomórkowymi.Ponadto zakwestionowaliśmy PDPL, identyfikując cele wiązania białek cytozolowych, które są bardziej złożone niż białka związane z błoną ze względu na ich właściwości dynamiczne i zaangażowanie w bardziej czasowe interakcje.PDPL zastosowano do dwóch białek, koaktywatora transkrypcji BRD4 i związanej z chorobą ligazy E3 Parkin.Te dwa białka zostały wybrane nie tylko ze względu na ich podstawowe funkcje biologiczne, ale także ze względu na ich znaczenie kliniczne i potencjał terapeutyczny.W przypadku tych dwóch POI zidentyfikowano dobrze znanych partnerów wiążących, a także niezarejestrowane cele.Warto zauważyć, że białko SFPQ związane z rozdziałem faz zostało potwierdzone przez co-IP, co może wskazywać na nowy mechanizm, za pomocą którego BRD4 (krótka izoforma) reguluje LLPS.Jednocześnie uważamy, że identyfikacja podłoży Parkin jest scenariuszem, w którym wymagana jest identyfikacja klejów pośrednich.Zidentyfikowaliśmy dwa niezidentyfikowane substraty parkinowe i potwierdziliśmy ich degradację na szlaku ubikwitynacja-proteasom.Ostatnio opracowano strategię pułapkowania opartą na mechanizmach, aby wykrywać substraty hydrolazy poprzez pułapkowanie ich enzymami.Chociaż jest to bardzo potężna metoda, nie nadaje się do analizy substratów biorących udział w tworzeniu dużych kompleksów i wymaga tworzenia wiązań kowalencyjnych między enzymem a substratem.Spodziewamy się, że PDPL można rozszerzyć o badanie innych kompleksów białkowych i rodzin enzymów, takich jak rodziny deubikwitynazy i metaloproteaz.
Opracowano nową formę miniSOG, zwaną SOPP3, z ulepszoną produkcją tlenu singletowego.Porównaliśmy miniSOG z SOPP3 i stwierdziliśmy lepszą wydajność znakowania, chociaż stosunek sygnału do szumu pozostał niezmieniony (rysunek uzupełniający 11).Postawiliśmy hipotezę, że optymalizacja SOPP3 (np. poprzez ukierunkowaną ewolucję) doprowadziłaby do wydajniejszych białek fotosensybilizatorów, które wymagają krótszego czasu naświetlania, a tym samym umożliwiają uchwycenie bardziej dynamicznych procesów komórkowych.Warto zauważyć, że obecna wersja PDPL jest ograniczona do środowiska komórkowego, ponieważ wymaga oświetlenia niebieskim światłem i nie może penetrować głębokich tkanek.Ta cecha wyklucza jej zastosowanie w badaniach na modelach zwierzęcych.Jednak połączenie optogenetyki z PDPL może stanowić okazję do badań na zwierzętach, zwłaszcza w mózgu.Ponadto inne zaprojektowane fotouczulacze na podczerwień również usuwają to ograniczenie.Obecnie trwają badania w tym obszarze.
Linię komórkową HEK293T uzyskano z ATCC (CRL-3216).Linia komórkowa dała wynik negatywny pod kątem infekcji mykoplazmą i była hodowana w DMEM (Thermo, #C11995500BT) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS, Vistech, #SE100-B) i 1% penicyliną/streptomycyną (Hyclone, #SV30010).rosnie w.
3-Aminofenylen (próbka 3) i (4-etynylofenylo)metanoamina (próbka 4) zakupiono w firmie Bidepharm.Propyloaminę (sonda 2) zakupiono w firmie Energy-chemicals.N-(2-aminofenylo)pent-4-ynamid (sonda 1) zsyntetyzowano zgodnie z opublikowanymi metodami.
W Tabeli Uzupełniającej 1 wymieniono konstrukty genetyczne zastosowane w tym badaniu.Sekwencje miniSOG i KillerRed sklonowano z podarowanego plazmidu z P. Zou (Peking University).Sekwencja kierująca do macierzy mitochondrialnej pochodziła z 23 N-końcowych aminokwasów COX4 i sklonowana do wskazanych wektorów przy użyciu zestawu Gibsona (Beyotime, #D7010S).Aby celować w błonę i jądro retikulum endoplazmatycznego, ludzkie DNA SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplifikowane metodą PCR z biblioteki cDNA komórek HEK293T i DNA H2B (podarowane przez D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) i sklonowane , jak wspomniano powyżej.O ile nie wskazano inaczej, inne geny białkowe stosowane do transfekcji i konstrukcji stabilnych linii komórkowych amplifikowano metodą PCR z biblioteki cDNA komórek HEK293T.G3S (GGGS) i G4S (GGGGS) zastosowano jako łączniki między białkiem przynęty a miniSOG.Do tych konstruktów fuzyjnych dodano znacznik epitopu V5 (GKPIPNPLLGLDST).W celu ekspresji u ssaków i ustanowienia stabilnej linii komórkowej, konstrukt fuzyjny miniSOG subklonowano do wektora lentiwirusowego pLX304.Do ekspresji bakteryjnej miniSOG wklonowano do wektora pET21a znakowanego 6xHis na C-końcu.
Komórki HEK293T wysiano w ilości 2,0 x 105 komórek na studzienkę w sześciostudzienkowych płytkach i transfekowano 24 godziny później rekombinowanymi plazmidami lentiwirusowymi (2,4 μg pLX304) i wirusowymi plazmidami pakującymi (1,5 μg psPAX2 i 1,2 μg pMD2.G) przy użyciu Lipo8000 (Beyotime , #C0533), około 80% fuzji.Po całonocnej transfekcji pożywkę zmieniono i inkubowano przez kolejne 24 godziny.Pobieranie wirusa prowadzono po 24, 48 i 72 godzinach.Przed infekcją docelowych linii komórkowych, pożywkę wirusową przefiltrowano przez filtr 0,8 μm (Merck, #millex-GP) i dodano polibren (Solarbio, #H8761) do stężenia 8 μg/ml.Po 24 godzinach komórki pozostawiono do regeneracji przez zmianę pożywki.Komórki selekcjonowano przy użyciu 5 μg/ml blastycydyny (Solarbio, #3513-03-9) do pierwszych trzech pasaży jako mniej rygorystyczna selekcja.Następnie stosowano 20 μg/ml jako bardziej rygorystyczny schemat w kolejnych trzech pasażach.
Komórki wysiano w 12-dołkowych komorach (Ibidi, #81201) przy gęstości około 20 000 komórek na dołek.Aby poprawić adhezję komórek HEK293T, dodać 50 µg/ml fibronektyny (Corning, #356008) rozcieńczonej w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, Sangon, #B640435) w 37°C.Komory poddano wstępnej obróbce przez 1 godzinę, a następnie usunięto PBS.Po 24 godzinach komórki przemyto raz PBS, inkubowano z 1 mM sondą 3 w świeżym zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS, Gibco, #14025092) przez 1 godzinę w 37°C, a następnie inkubowano z niebieską diodą LED (460 nm ).) naświetlano przez 10 min w temperaturze pokojowej.Następnie komórki przemyto dwukrotnie PBS i utrwalono 4% formaldehydem w PBS (Sangon, #E672002) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Nadmiar formaldehydu usunięto z utrwalonych komórek przez trzykrotne przemycie PBS.Komórki następnie permeabilizowano 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) w PBS i przemyto 3 razy PBS.Następnie wyjmij komorę i dodaj do każdej próbki 25 µl mieszaniny reakcyjnej typu click zawierającej 50 µM azydek Cy3 (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) i 0,5 mg/ml askorbinianu sodu (Aladdin, nr S105024) i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po szybkiej reakcji komórki przemyto sześciokrotnie PBS zawierającym 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST), a następnie zablokowano 5% BSA (Abcone, #B24726) w PBST przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Do immunobarwienia kolokalizacji komórki inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi we wskazanych warunkach: mysie mAb anty-V5 tag (1:500, CST, #80076), królicze mAb anty-Hsp60 (1:1000), ABclonal, #A0564), królicze poliklonalne przeciwciało przeciw kalneksynie (1:500, Abcam, #ab22595) lub królicze przeciwciało monoklonalne anty-lamina A/C (1:500; CST, #2032) w 4°C przez noc.Po trzykrotnym przemyciu PBST, komórki inkubowano z drugorzędowymi przeciwciałami: kozim anty-króliczym Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) rozcieńczonym 1:1000, kozim anty-mysim Alexa Fluor 594 (CST, #8889) rozcieńczonym 1:1000.rozcieńczenie Rozcieńczać w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Następnie komórki przemyto 3 razy PBST i wybarwiono kontrastowo DAPI (Thermo, #D1306) w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Po 3 płukaniach PBS, komórki zatopiono w 50% glicerolu (Sangon, #A600232) w PBS do obrazowania.Obrazy immunofluorescencyjne uzyskano przy użyciu mikroskopu konfokalnego ZEISS LSM 900 Airyscan2 i oprogramowania ZNE 3.5.
Do obrazowania fluorescencyjnego tlenu singletowego, komórki przemywano dwukrotnie buforem Hanks HEPES przed dodaniem 100 nM Si-DMA w buforze Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Po ekspozycji na światło komórki inkubowano w inkubatorze CO2 w 37°C przez 45 minut.Komórki następnie przemyto dwukrotnie buforem Hanks' HEPES i wybarwiono kontrastowo Hoechst w buforze Hanks' HEPES przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zwizualizowano przy użyciu mikroskopu konfokalnego ZEISS LSM 900., #M36008) w buforze HBSS zawierającym wapń i magnez.Po ekspozycji na światło lub doksorubicynę (MCE, #HY-15142A), komórki inkubowano w inkubatorze CO2 w 37°C przez 10 minut, przemyto dwukrotnie buforem HBSS i inkubowano z Hoechst w buforze HBSS w temperaturze pokojowej.minuty.Doksorubicynę zastosowano jako pozytywną kontrolę sondy, gdzie komórki traktowano 20 µM doksorubicyną w HBSS zawierającym 1% BSA przez 30 min.Obrazy immunofluorescencyjne uzyskano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 900.
Komórki HEK293T stabilnie wyrażające mito-miniSOG wysiano w gęstości około 30% na 15 cm szalkach.Po 48 godzinach, gdy osiągnięto ~80% konfluencję, komórki przemyto raz PBS, inkubowano z 1 mM Probe 3 w świeżym buforze HBSS przez 1 godzinę w 37°C, a następnie oświetlono niebieską diodą LED przez 10 minut w temperaturze pokojowej temperatura..Następnie komórki przemyto dwukrotnie PBS, zeskrobano i ponownie zawieszono w lodowatym buforze PBS zawierającym inhibitory proteazy wolne od EDTA (MCE, #HY-K0011).Komórki poddano lizie przez sonikację końcówki przez 1 minutę (1 sekunda włączenia i 1 sekunda przerwy przy amplitudzie 35%).Otrzymaną mieszaninę wirowano przy 15 871 xg przez 10 min w 4°C w celu usunięcia resztek, a stężenie supernatantu doprowadzono do 4 mg/ml przy użyciu zestawu do oznaczania białka BCA (Beyotime, #P0009).Połącz 1 ml powyższego lizatu z 0,1 mM fotodegradowalnego azydku biotyny (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM ligandu TBTA (Aladdin, #T162437) i 1 mM inkubator CuSO4 z dnem obracać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.Po szybkiej reakcji dodać mieszaninę do wstępnie zmieszanego roztworu (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) w 10 ml szklanej fiolce.Próbki wymieszano i odwirowano przy 4500 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Roztwory dolny i górny odrzucono, osad przemyto dwukrotnie 1 ml metanolu i odwirowano przy 15871 xg przez 5 min w 4°C.Dodać 1 ml 8 M mocznika (Aladdin, nr U111902) w 25 mM wodorowęglanu amonu (ABC, Aladdin, nr A110539) w celu rozpuszczenia osadu.Próbki rekonstytuowano 10 mM ditiotreitolem (Sangon, nr A100281 w 25 mM ABC) przez 40 minut w 55°C, a następnie dodano 15 mM świeżego jodoacetamidu (Sangon, nr A600539) w temperaturze pokojowej w ciemności.Alkilacja w ciągu 30 minut..W celu zatrzymania reakcji dodano dodatkowe 5 mM ditiotreitolu.Przygotuj około 100 µl kulek agarozowych NeutrAvidin (Thermo, #29202) dla każdej próbki, przemywając 3 razy 1 ml PBS.Powyższy roztwór proteomu rozcieńczono 5 ml PBS i inkubowano ze wstępnie przemytymi kulkami agarozowymi NeutrAvidin przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.Kulki następnie przemyto 3 razy 5 ml PBS zawierającym 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 razy 5 ml PBS zawierającym 1M mocznik i 3 razy 5 ml ddH2O.Perełki następnie zebrano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w 200 μl 25 mM ABC zawierającego 1 M mocznik, 1 mM CaCl2 (Macklin, #C805228) i 20 ng/μl trypsyny (Promega, #V5280).Trypsynizować przez noc w 37°C z rotacją.Reakcję zatrzymano przez dodanie kwasu mrówkowego (Thermo, # A117-50) aż pH osiągnęło 2-3.Kulki przemyto 3 razy 1 ml PBS zawierającego 0,2% SDS, 3 razy 1 ml PBS zawierającego 1 M mocznika, a następnie 3 razy 1 ml wody destylowanej.Zmodyfikowane peptydy uwolniono przez lekką lizę (365 nm) przez 90 min przy użyciu 200 μl 70% MeOH.Po odwirowaniu zebrano supernatant.Perełki następnie przemyto raz 100 µl 70% MeOH i połączono supernatanty.Próbki suszono w koncentratorze próżniowym Speedvac i przechowywano w -20°C do czasu analizy.
Aby zidentyfikować i określić ilościowo peptydy modyfikowane tlenem singletowym, próbki ponownie rozpuszczono w 0,1% kwasie mrówkowym i 1 μg peptydów analizowano przy użyciu spektrometru masowego Orbitrap Fusion Lumos Tribrid wyposażonego w źródło nano ESI z firmy Tune i Xcalibur z oprogramowania producenta 4.3.Próbki rozdzielano na wewnętrznie upakowanej kolumnie kapilarnej 75 µm × 15 cm z 3 µm materiałem C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) i podłączano do systemu EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Peptydy rozdzielono liniową 95-minutową chromatografią gradientową od 8% rozpuszczalnika B do 50% rozpuszczalnika B (A = 0,1% kwas mrówkowy w wodzie, B = 0,1% kwas mrówkowy w 80% acetonitrylu), następnie liniowo zwiększono do 98% B min w 6 min przy natężeniu przepływu 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos zbiera dane na przemian z pełnego skanu MS i skanu MS2 w zależności od danych.Napięcie rozpylania ustawiono na 2,1 kV, a temperatura kapilary transportującej jony wynosiła 320°C.Widma MS (350-2000 m/z) zbierano z rozdzielczością 120 000, AGC 4 × 105 i maksymalnym czasem wejściowym 150 ms.10 najczęstszych wielokrotnie naładowanych prekursorów w każdym pełnym skanie poddano fragmentacji przy użyciu HCD ze znormalizowaną energią zderzenia 30%, kwadrupolowym oknem izolacji 1,6 m/z i rozdzielczością 30 000.Cel AGC dla tandemowej spektrometrii masowej przy użyciu 5×104 i maksymalnym czasie wejściowym 150 ms.Wyjątek dynamiczny jest ustawiony na 30 sekund. Jony nieprzypisane lub o ładunku 1+ i >7+ zostały odrzucone dla MS/MS. Jony nieprzypisane lub o ładunku 1+ i >7+ zostały odrzucone dla MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ i >7+ были отклонены для МС/МС. Jony nieprzypisane lub jony o ładunku 1+ i >7+ zostały odrzucone dla MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ i >7+ были отклонены для МС/МС. Nieokreślone jony lub jony o ładunkach 1+ i >7+ zostały odrzucone dla MS/MS.
Surowe dane przetwarzane są za pomocą platformy obliczeniowej FragPipe opartej na MSFragger.Błąd systematyczny masy i odpowiednie aminokwasy określono stosując otwarty algorytm wyszukiwania z tolerancją masy prekursora od -150 do 500 Da.Zmodyfikowane peptydy zidentyfikowano następnie stosując modyfikacje histydyny z przyrostami masy +229,0964 i +247,1069 Da w PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Komórki stabilnie eksprymujące zfuzowany gen miniSOG wysiano na 6 cm szalkach.Po osiągnięciu ~80% konfluencji, komórki przemyto raz HBSS (Gibco, #14025092), następnie inkubowano z sondami chemicznymi w HBSS przez 1 godzinę w 37°C i oświetlono niebieskim światłem.10W LED przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Aby określić, jaki rodzaj reaktywnych form tlenu jest zaangażowany w PDPL, 0,5 mM witaminy C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), Jako suplementy do komórek dodano 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3.Po przemyciu zimnym PBS komórki zeskrobano, zebrano w 1,5 ml probówkach wirówkowych i sonikowano końcówką przez 1 min w 200 µl PBS z 1x inhibitorem proteazy bez EDTA (1 s i 1 s bez, amplituda 35%).Otrzymaną mieszaninę odwirowano przy 15 871 x g przez 10 min w 4°C i stężenie supernatantu doprowadzono do 1 mg/ml przy użyciu zestawu do oznaczania białka BCA.Około 50 µl powyższego lizatu inkubowano z 0,1 mM azydkiem rodaminy (Aladdin, nr T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM ligandem TBTA i 1 mM CuSO4 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, obracając od dołu do góry.Po reakcji typu click przeprowadzono wytrącanie acetonem przez dodanie do próbek 250 μl wstępnie schłodzonego acetonu, inkubację w -20°C przez 20 min i wirowanie przy 6010 xg przez 10 min w 4°C.Zebrać osad i gotować w 50 µl 1x buforu Laemmli'ego przez 10 min w 95 °C.Następnie próbki analizowano na długich żelach SDS-PAGE i wizualizowano przy użyciu systemu obrazowania Bio-rad ChemiDoc MP Touch z oprogramowaniem Image Lab Touch.
Ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego białka miniSOG-6xHis przeprowadzono jak opisano wcześniej.W skrócie, komórki E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) transformowano pET21a-miniSOG-6xHis i ekspresję białka indukowano 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Po lizie komórek białka oczyszczono przy użyciu kulek agarozowych Ni-NTA (MCE, nr 70666), dializowano wobec PBS i przechowywano w -80°C.
Dla testu zbliżeniowego in vitro opartego na przeciwciałach, zmieszaj 100 μM oczyszczonego miniSOG, 1 mM sondę 3 i 1 μg mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-znakującego (TransGen, #HT501-01) w PBS do całkowitej objętości reakcji 50 μl..Mieszaninę reakcyjną naświetlano niebieskim światłem LED przez 0, 2, 5, 10 i 20 min w temperaturze pokojowej.Mieszaninę inkubowano z 0,1 mM azydkiem biotyny-PEG3 (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM ligandem TBTA i 1 mM CuSO4 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z ruchem do góry.Po szybkiej reakcji dodaj 4x bufor Laemmli'ego bezpośrednio do mieszaniny i gotuj w 95°C przez 10 min.Próbki analizowano na żelach SDS-PAGE i analizowano metodą western blotting ze streptawidyną-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Syntetyczny peptyd zawierający histydynę z C-końcową amidacją (LHDALDAK-CONH2) zastosowano do analizy znakowania in vitro opartego na pobliskim peptydzie.W tym teście, 100 μM oczyszczonego miniSOG, 10 mM sondy 3 i 2 μg/ml syntetycznego peptydu zmieszano w PBS w całkowitej objętości reakcji 50 μl.Mieszaninę reakcyjną naświetlano niebieskim światłem LED przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.Jeden mikrolitr próbki analizowano stosując system LC-MS (Waters, spektrometr masowy SYNAPT XS Mobility Time-of-Flight z oprogramowaniem do analizy widma MassLynx).
Komórki HEK293T stabilnie wyrażające gen fuzyjny miniSOG wysiano na 10 cm szalkach dla linii o różnej lokalizacji organelli (Mito, ER, Nucleus) i 15 cm szalkach dla linii Parkin-miniSOG i BRD4-miniSOG.Po osiągnięciu ~90% konfluencji, komórki przemyto raz HBSS, następnie inkubowano z sondą 3 w HBSS przez 1 godzinę w 37°C i oświetlono 10 W niebieską diodą LED w temperaturze pokojowej.Do bezkontaktowego znakowania Parkin, 10 µM nośnika protonowo-karbonylowego cyjanku m-chlorofenylohydrazon CCCP (Solarbio, #C6700) z sondą 3 w HBSS dodawano na 1 godzinę w 37°C.Etapy lizy komórek, chemia klików, redukcji i alkilowania były takie same, jak opisane powyżej, z tym wyjątkiem, że dodano 2 mg lizatu i w reakcji kliknięto azydek biotyny PEG3 zamiast fotodegradowalnego azydku biotyny.Po wzbogaceniu kulki przemyto 3 razy 5 ml PBS zawierającego 0,2% SDS, 3 razy 5 ml PBS zawierającego 1 M mocznika i 3 razy 5 ml PBS.Następnie 2 µg trypsyny dodano do 300 µl 25 mM ABC zawierającego 1 M mocznik w celu rozszczepienia białka przez noc w 37°C.Reakcję zatrzymano przez dodanie kwasu mrówkowego do osiągnięcia pH 2-3.Po trypsynizacji na perełkach roztwór peptydu odsolono przy użyciu kolumny SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) i osuszono w koncentratorze próżniowym Speedvac.Peptydy ponownie rozpuszczono w 0,1% kwasie mrówkowym i 500 ng peptydów analizowano przy użyciu spektrometru masowego Orbitrap Fusion Lumos Tribrid wyposażonego w opisane powyżej źródło nano-ESI.Peptydy rozdzielano na komercyjnych kolumnach wstępnych RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, nr 164946) i analitycznych kolumnach RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, nr 164941), obie wypełnione 2 μm.gradient od 8% do 35% ACN w ciągu 60 minut, a następnie zwiększany liniowo do 98% B w ciągu 6 minut przy natężeniu przepływu 300 Nl/min.Widma MS (350-1500 m/z) zbierano z rozdzielczością 60 000, AGC 4 × 105 i maksymalnym czasem wejściowym 50 ms.Wybrane jony poddano sekwencyjnej fragmentacji przez HCD w cyklach 3 s przy znormalizowanej energii zderzenia 30%, oknie izolacji kwadrupolowej 1,6 m/z i rozdzielczości 15000. Cel AGC tandemowego spektrometru masowego 5 × 104 i maksymalny czas wtrysku 22 ms.Wykluczenie dynamiczne jest ustawione na 45 sekund. Jony nieprzypisane lub o ładunku 1+ i >7+ zostały odrzucone dla MS/MS. Jony nieprzypisane lub o ładunku 1+ i >7+ zostały odrzucone dla MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ i >7+ были отклонены для МС/МС. Jony nieprzypisane lub jony o ładunku 1+ i >7+ zostały odrzucone dla MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ i >7+ были отклонены для МС/МС. Nieokreślone jony lub jony o ładunkach 1+ i >7+ zostały odrzucone dla MS/MS.
Etapy przygotowania próbki aż do wzbogacenia kulek NeutrAvidin były takie same jak w analizie LC-MS/MS opisanej powyżej.Około 50 μg lizatu zastosowano jako wsad do kontroli ładowania, a 2 mg lizatu użyto do reakcji typu click.Po wzbogaceniu i przemyciu neutrawidyną, związane białka eluowano przez dodanie 50 μl buforu Laemmli'ego do kulek żywicy agarozowej i gotowanie w 95°C przez 5 minut.Wprowadzone obciążenie kontrolne i próbki wzbogacone w kulki analizowano za pomocą SDS-PAGE i przenoszono na membrany PVDF (Millipore, #ISEQ00010) standardowymi metodami Western blot.Błony zablokowano 5% odtłuszczonym mlekiem (Sangon, #A600669) w TBS zawierającym 0,1% tween-20 (TBST) i inkubowano kolejno z pierwszorzędowymi i drugorzędowymi przeciwciałami.Pierwotne przeciwciała rozcieńczono 1:1000 w 5% odtłuszczonym mleku w TBST i inkubowano przez noc w 4°C.Przeciwciała wtórne zastosowano w stosunku 1:5000 i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.Błony wizualizowano za pomocą chemiluminescencji przy użyciu systemu obrazowania Chemidoc MP.Wszystkie nieprzycięte skany blotów i żeli na rysunku są przedstawione jako dane surowe.
Pierwotne przeciwciała stosowane w tym badaniu obejmowały królicze przeciwciało monoklonalne anty-SFPQ (CST, nr 71992), królicze przeciwciało monoklonalne anty-FUS (CST, nr 67840), królicze przeciwciało poliklonalne anty-NSUN2 (Proteintech, nr 20854-1- AP), królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko mSin3A (Abcam, #ab3479), mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko znacznikowi (TransGen, #HT201-02), mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko β-aktynie (TransGen, #HC201-01), królicze przeciwciało -przeciwciało monoklonalne CDK2 (ABclonal, #A0094), królicze przeciwciało monoklonalne przeciwko CTBP1 (ABclonal, #A11600), królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko DUT (ABclonal, #A2901), królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko PSMC4 (ABclonal, #A2505), królicze przeciwciało Przeciwciało poliklonalne DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Przeciwciała te zastosowano w rozcieńczeniu 1:1000 w 5% odtłuszczonym mleku w TBST.Drugorzędowe przeciwciała stosowane w tym badaniu obejmowały antykrólicze IgG (TransGen, #HS101-01), anty-mysie IgG (TransGen, #HS201-01) w rozcieńczeniu 1:5000.
W celu dalszego zbadania, czy BRD4 oddziałuje z SFPQ, stabilne komórki HEK293T i BRD4-miniSOG z nadekspresją HEK293T wysiano na 10 cm szalkach.Komórki przemyto zimnym PBS i lizowano w 1 ml buforu do lizy Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) z inhibitorem proteazy wolnym od EDTA przez 30 minut w 4°C.Następnie lizaty zebrano w 1,5 ml probówkach wirówkowych i odwirowano przy 15 871 xg przez 10 min w 4°C.Supernatant zebrano i inkubowano z 5 µg mysiego przeciwciała monoklonalnego znakowanego anty-V5 (CST, #80076) przez noc w 4°C.Przemyj około 50 µl kulek magnetycznych białka A/G (MCE, #HY-K0202) dwukrotnie PBS zawierającym 0,5% Tween-20.Następnie lizaty komórkowe inkubowano z kulkami magnetycznymi przez 4 godziny w 4°C z rotacją od dołu do góry.Następnie kulki przemyto czterokrotnie 1 ml buforu PBST i gotowano w 95°C przez 5 min.Próbki analizowano na żelach SDS-PAGE i przenoszono na membrany PVDF przy użyciu standardowych metod Western blot.Błony zablokowano w 5% odtłuszczonym mleku w TBST i inkubowano kolejno z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi.Pierwotne przeciwciało Królicze przeciwciało monoklonalne anty-SFPQ (CST, #71992) zastosowano w stosunku 1:1000 w 5% odtłuszczonym mleku w TBST i inkubowano przez noc w 4°C.Przeciwkrólicze IgG zastosowano w stosunku 1:5000 i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.Błony wizualizowano za pomocą chemiluminescencji przy użyciu systemu obrazowania Chemidoc MP.
Wszystkie struktury użyte do analizy pola powierzchni dostępnej dla rozpuszczalnika (SASA) uzyskano z Protein Data Bank (PDB)52 lub AlphaFold Protein Structure Database53.Dla każdej pozostałości obliczono absolutne SASA przy użyciu programu FreeSASA.Tylko pełne i jednoznaczne dane SASA dla znakowanej histydyny i jej sąsiadów zostały wykorzystane do uzyskania średniej SASA dla każdej struktury.Względną dostępność rozpuszczalnika (RSA) dla każdej histydyny obliczono dzieląc bezwzględną wartość SASA przez empiryczne maksymalne możliwe pole powierzchni pozostałości dostępne dla rozpuszczalnika.Wszystkie histydyny były następnie klasyfikowane jako ukryte, jeśli średnia RSA była poniżej 20%, w przeciwnym razie eksponowana56.
Surowe pliki uzyskane w trybie DDA zostały przeszukane przy użyciu Proteome Discoverer (v2.5) lub MSfragger (Fragpipe v15.0) w odpowiedniej zweryfikowanej bazie danych SwissProt zawierającej powszechne zanieczyszczenia.Peptydy wymagały pełnej trypsyny z dwoma brakującymi miejscami cięcia, metylacji karbamoilu jako stałej modyfikacji i utleniania metioniny jako modyfikacji dynamicznej.Tolerancje masy prekursora i fragmentu ustawiono odpowiednio na 10 ppm i 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Trafienia zanieczyszczające zostały usunięte, a białka przefiltrowane w celu uzyskania fałszywego wskaźnika wykrywania <1%. Trafienia zanieczyszczające zostały usunięte, a białka przefiltrowane w celu uzyskania fałszywego wskaźnika wykrywania <1%. Raporty dzienników mają dostęp do dzienników, białych portali społecznościowych, blogów społecznościowych <1%. Trafienia zanieczyszczenia zostały usunięte, a białka przefiltrowane, aby uzyskać fałszywą wykrywalność <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Powiadomienia o dostępie do dzienników i dzienników, a także białe ogłoszenia o dostępie do londyńskiego miasta <1%. Trafienia zanieczyszczenia zostały usunięte, a białka przefiltrowane, aby uzyskać odsetek wyników fałszywie dodatnich <1%.Do analizy ilościowej bez użycia znaczników zastosowano znormalizowaną zawartość białka z trzech powtórzeń biologicznych.Analizę lokalizacji subkomórkowej białka przeprowadzono przy użyciu analizy Gene Ontology (GO) z DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 i baz danych skompilowanych i opublikowanych przez grupę Alice Ting.Mapa wulkanu została uzyskana od Perseusza (v1.6.15.0). Zmiany krotności liczebności białka testowano pod kątem istotności statystycznej za pomocą dwustronnego testu t, a trafienia białka identyfikowano ze zmianą liczebności >2 (o ile nie podano inaczej) i wartością p <0,05. Zmiany krotności liczebności białka testowano pod kątem istotności statystycznej za pomocą dwustronnego testu t, a trafienia białka identyfikowano ze zmianą liczebności >2 (o ile nie podano inaczej) i wartością p <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Zmiany krotności zawartości białka testowano pod kątem istotności statystycznej za pomocą dwustronnego testu t, a dopasowania białka identyfikowano ze zmianą zawartości >2 (o ile nie zaznaczono inaczej) i wartością p <0,05.使用双边t 检验测试蛋白质丰度倍数变化的统计显着性，并确定蛋白质命中的丰度变化> 2（除非另有说明）和p 值<0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Istotność statystyczną krotności zmian zawartości białka zbadano za pomocą dwustronnego testu t, a dopasowania białka określono dla zmian zawartości >2 (o ile nie wskazano inaczej) i wartości p <0,05.Analizę interakcji białek przeprowadzono za pomocą analizy GO wraz z bazą danych String.
Przeprowadzono trzy powtórzenia biologiczne z podobnymi wynikami.Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą programu GraphPad Prism (oprogramowanie GraphPad), a wykresy wulkanów wygenerowano za pomocą programu Perseus (wersja 1.6.15.0).Aby porównać dwie grupy, wyznaczono wartości p za pomocą dwustronnego testu t-Studenta.Na wykresach wulkanicznych uwzględniono tylko pojedyncze białka zidentyfikowane co najmniej dwukrotnie w grupie eksperymentalnej, a odpowiadające im brakujące wartości w grupie kontrolnej zastąpiono Perseuszem z rozkładu normalnego, aby można było obliczyć wartość p.Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.W analizach proteomicznych do analizy statystycznej zachowano obfitość białek, które pojawiły się w co najmniej dwóch powtórzeniach biologicznych.Do wstępnego określenia wielkości próby nie zastosowano metod statystycznych.Eksperymenty nie są przypadkowe.Badacze nie byli ślepi na zadania podczas eksperymentu i oceny wyników.
Więcej informacji na temat projektu badania można znaleźć w streszczeniu raportu Nature Research, do którego link znajduje się w tym artykule.
Dane spektrometrii mas uzyskane w tym badaniu zostały przesłane do Konsorcjum ProteomeXchange za pośrednictwem repozytorium partnerów iProX57 pod identyfikatorem zestawu danych PXD034811 (zestaw danych PDPL-MS).Surowe dane są dostarczane w postaci surowych plików danych.Ten artykuł zawiera oryginalne dane.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Poznanie sąsiedztwa: wykorzystanie biotynylacji zależnej od bliskości do charakteryzowania kompleksów białkowych i mapowania organelli. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Poznanie sąsiedztwa: wykorzystanie biotynylacji zależnej od bliskości do charakteryzowania kompleksów białkowych i mapowania organelli.Gingras, AS, Abe, KT i Raut, B. Znajomość otoczenia: wykorzystanie zależnej od bliskości biotynylacji do charakteryzowania kompleksów białkowych i mapowania organelli. Gingras, AC, Abe, KT i Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并绘制细胞器图。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Zrozumienie sąsiedztwa: wykorzystaj zależność sąsiedztwa od życia biologicznego.Gingras, AS, Abe, KT i Raut, B. Zrozumienie bliskości: charakterystyka kompleksów białkowych i mapowanie organelli za pomocą biotynylacji zależnej od bliskości.Aktualny.Moja opinia.Chemiczny.biologia 48, 44–54 (2019).
Geri, JB i in.Mapowanie mikrośrodowiska poprzez przekazywanie energii Dextera do komórek odpornościowych.Nauka 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL i in.Sieci w skali dwóch proteomów wykrywają specyficzne dla komórki przemodelowanie ludzkiego interaktomu.Komórki 184, 3022-3040.e3028 (2021).
Czas publikacji: 15 września-2022
