Tradycyjne strategie diagnostyczne służące do wykrywania chorób zakaźnych wymagają użycia narzędzi laboratoryjnych, które nie nadają się do badań w placówkach opieki (POCT).Nowa mikrofluidyka to wysoce zminiaturyzowana, zautomatyzowana i zintegrowana technologia, która jest potencjalną alternatywą dla tradycyjnych metod szybkiej, taniej i dokładnej diagnostyki na miejscu.Metody diagnostyki molekularnej są szeroko stosowane w urządzeniach mikroprzepływowych jako najskuteczniejsze metody wykrywania patogenów.Niniejszy przegląd podsumowuje ostatnie postępy w mikroprzepływowej diagnostyce molekularnej chorób zakaźnych, zarówno z perspektywy akademickiej, jak i przemysłowej.Najpierw opisujemy typowe przetwarzanie kwasów nukleinowych na chipie, w tym wstępną obróbkę próbki, amplifikację i odczyt sygnału.Następnie porównuje się cechy, zalety i wady czterech typów platform mikroprzepływowych.Następnie omówimy zastosowanie testów cyfrowych do bezwzględnej oceny ilościowej kwasów nukleinowych.Jako dowód na obecny stan rynku podsumowano zarówno klasyczne, jak i najnowsze komercyjne urządzenia do diagnostyki molekularnej oparte na mikroprzepływach.Na koniec proponujemy przyszłe kierunki mikroprzepływowej diagnostyki chorób zakaźnych.
Choroby zakaźne są wywoływane przez patogeny, w tym bakterie, wirusy i pasożyty, które występują na całym świecie.W przeciwieństwie do innych chorób, patogeny szybko ulegają zakażeniu i rozprzestrzeniają się między ludźmi a zwierzętami gospodarzem poprzez inokulację, media powietrzne i wodne [1].Zapobieganie chorobom zakaźnym ma kluczowe znaczenie jako środek zdrowia publicznego.Trzy główne strategie zwalczania chorób zakaźnych: (1) kontrola źródła infekcji;(2) przerwanie toru transmisji;(3) ochrona podatnych populacji.Wśród głównych strategii, kontrola źródła infekcji jest uważana za najważniejszą strategię ze względu na wygodę i niski koszt.Szybka diagnoza, izolacja i leczenie osób zakażonych mają kluczowe znaczenie, wymagają szybkich, czułych i dokładnych strategii diagnostycznych [2].Obecna diagnostyka chorób zakaźnych zazwyczaj łączy badanie kliniczne oparte na objawach i badaniach laboratoryjnych, takich jak hodowla komórek i diagnostyka molekularna, które wymagają wyszkolonego personelu, pracochłonnych procedur i drogiego sprzętu badawczego [3, 4].Zapobieganie wybuchom chorób zakaźnych wymaga szybkiej, niedrogiej i dokładnej diagnozy lokalnej, zwłaszcza na obszarach o ograniczonych zasobach, gdzie choroby zakaźne są powszechne i ciężkie [5], a także leczenia w dziczy lub na polu bitwy, gdzie nagłe wypadki są nieprzewidywalne..opieka medyczna jest ograniczona [6].W tym kontekście mikroprzepływy to technologia, która łączy technologie systemów mikroelektromechanicznych, nanotechnologię lub materiałoznawstwo w celu precyzyjnej manipulacji płynami [7,8,9,10], zapewniając nowe możliwości wykrywania w miejscu opieki (POCT).) czynniki zakaźne poza szpitalami i laboratoriami.W porównaniu z tradycyjną, czasochłonną diagnostyką, technologia mikroprzepływowa zapewnia oszczędność próbek i kosztów diagnostyki molekularnej podczas epidemii choroby.Globalne rozprzestrzenianie się choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) jest spowodowane koronawirusem zespołu ostrej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), dlatego ponownie podkreśla się znaczenie mikroprzepływów dla szybkiego zapobiegania i kontroli pandemii [11, 12 , 13].W przeciwieństwie do tradycyjnej diagnostyki, mikroprzepływowa POCT wykorzystuje małe przenośne urządzenia, od analizatorów stacjonarnych po małe paski testowe strumienia bocznego do testowania w pobliżu punktu pobierania próbek [14].Testy te charakteryzują się uproszczonym przygotowaniem próbki lub brakiem przygotowania próbki, szybkie wzmocnienie sygnału i czułe odczyty sygnału, co skutkuje krótkim czasem trwania i dokładnymi wynikami w ciągu kilku minut.Dostępność i masowa produkcja przyrządów do opieki zdrowotnej opartych na mikroprzepływach rozszerzyła ich opłacalne i bezpośrednie zastosowania diagnostyczne poza szpitalem, w pobliżu pacjenta, a nawet w domu.
Wśród istniejących strategii diagnozowania chorób zakaźnych diagnostyka molekularna jest jedną z najbardziej czułych [15, 16].Ponadto diagnostyka molekularna jest często wykorzystywana jako złoty standard w ciągłym wykrywaniu COVID-19, umożliwiając bezpośrednie wykrycie specyficznych dla wirusa regionów RNA lub DNA przed wystąpieniem odpowiedzi immunologicznej [17, 18].W obecnym przeglądzie przedstawiamy najnowsze postępy w opartych na mikrofluidyce molekularnych procesach diagnostycznych chorób zakaźnych, z perspektywy akademickiej do przyszłych perspektyw przemysłowych (ryc. 1).Zaczniemy od trzech kluczowych etapów wykrywania kwasów nukleinowych: wstępnej obróbki próbki na chipie, amplifikacji kwasu nukleinowego i odczytu sygnału.Następnie porównaliśmy różne typy platform mikroprzepływowych pod kątem ich budowy i funkcji, wykazując unikalne cechy (mocne i słabe strony).Cyfrowe wykrywanie kwasów nukleinowych jest dalej omawiane i podawane jako przykład technologii trzeciej generacji do bezwzględnego oznaczania ilościowego cząsteczek zakaźnych patogenów.Ponadto zaprezentowanych zostanie kilka typowych i najnowszych komercyjnych urządzeń POCT, aby zademonstrować aktualny stan rynku mikroprzepływowych POCT do diagnostyki molekularnej.Omówimy również i wyjaśnimy naszą wizję przyszłych zastosowań.
Moduły chipów mikroprzepływowych do wykrywania kwasów nukleinowych można podzielić na trzy kategorie (próbkowanie, rozpoznawanie i sygnalizacja) ze względu na ich funkcje [19].Wśród tych modułów moduł pobierania próbek realizuje głównie lizę próbki i ekstrakcję kwasu nukleinowego.Moduł czujnika steruje głównie konwersją i wzmacnianiem sygnałów kwasów nukleinowych.Moduł sygnalizacyjny wykrywa sygnał przetworzony i przetworzony przez moduł czujnikowy.W oparciu o proces wykrywania kwasów nukleinowych na chipie, podsumujemy różne chipy, które mogą realizować funkcję „wejścia i wyjścia”.
Pierwszym krokiem w wykrywaniu kwasu nukleinowego jest ekstrakcja kwasu nukleinowego, tj. wyizolowanie docelowego kwasu nukleinowego z oryginalnej próbki.Ekstrakcja kwasu nukleinowego jest przeprowadzana w celu oczyszczenia kwasów nukleinowych z innych zanieczyszczeń molekularnych, zapewnienia integralności struktury pierwszorzędowej cząsteczek kwasu nukleinowego i optymalizacji wyników.Ekstrakcja kwasu nukleinowego wymaga niezbędnej lizy próbki i wychwytu kwasu nukleinowego, których jakość i wydajność mają ogromny wpływ na wyniki badań i diagnostyki.Wszelkie subtelne skutki uboczne podczas ekstrakcji mogą ograniczyć dalsze wykrywanie.Na przykład, metody reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i pętli izotermicznej amplifikacji (LAMP) są hamowane przez niektóre pozostałości rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol i izopropanol, w odczynnikach do izolacji kwasów nukleinowych [20].Ekstrakcja ciecz-ciecz i ekstrakcja do fazy stałej to najpopularniejsze metody izolacji kwasów nukleinowych [21], jednak ekstrakcja ciecz-ciecz na chipie jest bardzo ograniczona, ponieważ odczynniki stosowane w ekstrakcji ciecz-ciecz powodują korozję większości wiórów mikroprzepływowych .W tym miejscu wyróżniamy metody ekstrakcji do fazy stałej oparte na mikromacierzach i porównujemy ich zalety i wady.
Krzem jest materiałem substratowym kompatybilnym z kwasami nukleinowymi ze względu na jego biokompatybilność, stabilność i łatwość modyfikacji [22].Co ważne, po modyfikacji krzemionką lub innymi materiałami, kompozyt ten wykazuje właściwości adsorpcji ujemnie naładowanych kwasów nukleinowych w warunkach niskiego pH, o wysokim zasoleniu, podczas elucji roztworami o wysokim pH, o niskiej zawartości soli.W oparciu o to zjawisko możliwe jest oczyszczenie kwasu nukleinowego.
Do ekstrakcji kwasów nukleinowych w mikroprzepływach stosowano różne formy materiałów na bazie krzemionki, takie jak kulki krzemionkowe, proszki, filtry z mikrowłókien i membrany krzemionkowe [23, 24, 25, 26].W zależności od właściwości materiału materiały na bazie krzemu mogą być stosowane w mikroukładach na różne sposoby.Na przykład granulki krzemionki, proszki i komercyjne nanofiltry można po prostu umieścić w porach lub mikrokanalikach chipów mikroprzepływowych i pomóc w ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbek [27, 28, 29].Membrany krzemionkowe o zmodyfikowanej powierzchni mogą być również stosowane do szybkiego oczyszczania DNA z patogenów przy niskich kosztach.Na przykład Wang i in.[30] Dzięki połączeniu denaturujących reakcji amplifikacji z wymianą łańcuchów za pośrednictwem pęcherzyków z błonami krzemionkowymi pokrytymi oligosacharydami chitozanu wprowadzono wszechstronny przenośny system, który z powodzeniem wykrywał 102–108 jednostek tworzących kolonie.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., a obecność wirusa była łatwo widoczna.Powell i in.[31] Mikromacierze na bazie krzemu zostały następnie wykorzystane do wykrycia wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), wirusa Zika i wirusa brodawczaka ludzkiego oraz automatycznej propagacji, w której opracowano kręty mikroreaktor o pojemności 1,3 μl do wychwytywania wirusów RNA.i wykonać amplifikację in situ.Oprócz tych metod, mikrokolumny krzemionkowe modyfikowane powierzchniowo również odgrywają kluczową rolę w ekstrakcji kwasów nukleinowych, ponieważ geometria i właściwości materiału modyfikującego znacznie zwiększają wydajność ekstrakcji.Chen i in.[32] zaproponowali mikroprzepływową platformę do izolacji RNA o niskim stężeniu w oparciu o mikrokolumny krzemowe pokryte aminami.To urządzenie mikroprzepływowe integruje układ mikrofilarów 0,25 cm2 na podłożu krzemowym, aby osiągnąć wyższą wydajność ekstrakcji dzięki konstrukcji o wysokim stosunku powierzchni do objętości.Zaletą tej konstrukcji jest to, że urządzenie mikroprzepływowe może osiągnąć wydajność ekstrakcji kwasu nukleinowego do 95%.Te strategie oparte na krzemie pokazują wartość szybkiego izolowania kwasów nukleinowych przy niskich kosztach.W połączeniu z chipami mikroprzepływowymi strategie ekstrakcji oparte na krzemie mogą nie tylko zwiększyć skuteczność wykrywania kwasów nukleinowych, ale także ułatwić miniaturyzację i integrację urządzeń analitycznych [20].
Metody separacji magnetycznej wykorzystują cząstki magnetyczne do izolacji kwasów nukleinowych w obecności zewnętrznego pola magnetycznego.Powszechnie stosowane cząstki magnetyczne obejmują cząstki magnetyczne Fe3O4 lub γ-Fe2O3 pokryte krzemionką, amino i karboksylem [33,34,35,36].Cechą wyróżniającą cząstki magnetyczne w porównaniu z metodami SPE na bazie krzemu jest łatwość manipulacji i sterowania za pomocą magnesów zewnętrznych.
Wykorzystując oddziaływanie elektrostatyczne między kwasami nukleinowymi a krzemionką, w warunkach wysokiego zasolenia i niskiego pH, kwasy nukleinowe są adsorbowane na powierzchni cząstek magnetycznych pokrytych krzemionką, natomiast w warunkach niskiego zasolenia i wysokiego pH cząsteczki można wypłukać ponownie..Kulki magnetyczne pokryte krzemionką umożliwiają ekstrakcję DNA z próbek o dużej objętości (400 μl) za pomocą ruchu kontrolowanego magnetycznie [37].W ramach demonstracji Rodriguez-Mateos i in.[38] zastosowali przestrajalne magnesy do kontrolowania przenoszenia kulek magnetycznych do różnych komór.Na podstawie cząstek magnetycznych pokrytych krzemionką można wyekstrahować 470 kopii/ml genomowego RNA SARS-CoV-2 z próbek ścieków do wykrywania odwrotnej transkrypcji LAMP (RT-LAMP), a odpowiedź można odczytać w ciągu 1 godziny.gołym okiem (ryc. 2a).
Urządzenia na bazie materiałów magnetycznych i porowatych.Schemat koncepcyjny urządzenia mikroprzepływowego IFAST RT-LAMP do wykrywania RNA SARS-CoV-2 (na podstawie [38]).b Mikrourządzenie wirówkowe do dSPE kwasu nukleinowego z wymazu policzkowego (zaadaptowane z [39]).c Wbudowany koncentrator próbek z własnym zasilaniem przy użyciu karty FTA® (zaadaptowanej z [50]).d Bibuła filtracyjna Fusion 5 modyfikowana chitozanem (na podstawie [51]).SARS-CoV-2 koronawirus 2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego, amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji RT-LAMP, partnerzy technologiczni FTA Finders, kwas nukleinowy NA
Dodatnio naładowane cząstki magnetyczne są idealne do przyłączania szkieletu fosforanowego kwasu nukleinowego.Przy pewnym stężeniu soli ujemnie naładowane grupy fosforanowe kwasów nukleinowych mogą być naładowane dodatnio na powierzchni magnetycznych cząstek kompozytowych.Dlatego do ekstrakcji kwasów nukleinowych opracowano nanocząstki magnetyczne o szorstkiej powierzchni i dużej gęstości grup aminowych.Po magnetycznej separacji i blokowaniu magnetyczne nanocząstki i kompleksy DNA mogą być bezpośrednio stosowane w reakcji PCR, co eliminuje konieczność skomplikowanych i czasochłonnych operacji oczyszczania i elucji [35].Nanocząstki magnetyczne pokryte ujemnymi grupami karboksylowymi zastosowano również do separacji kwasów nukleinowych zaadsorbowanych na powierzchniach w roztworach glikolu polietylenowego o wysokim stężeniu i chlorku sodu [36].W przypadku tych kulek magnetycznych o zmodyfikowanej powierzchni ekstrakcja DNA jest zgodna z dalszą amplifikacją.Dignan i in.[39] opisali zautomatyzowaną i przenośną wirówkową platformę mikroprzepływową do wstępnej obróbki kwasów nukleinowych, umożliwiającą personelowi nietechnicznemu korzystanie z niej na miejscu.Ponadto zgodność wyizolowanego DNA z LAMP, metodą dobrze nadającą się do analizy kwasów nukleinowych w miejscu opieki, dodatkowo wykazuje minimalne wymagania sprzętowe i przydatność do testów kolorymetrycznych (ryc. 2b).
Metody kulek magnetycznych oferują możliwość automatycznej ekstrakcji, z których niektóre istnieją w komercyjnych automatycznych ekstraktorach kwasów nukleinowych [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Pekin, Chiny) i Biomek®;Beckman (Miami, USA).), Floryda, USA)].Zalety łączenia kulek magnetycznych z mikroprzepływami można wykorzystać do wydajnej automatycznej ekstrakcji kwasów nukleinowych, co może potencjalnie przyspieszyć rozwój diagnostyki molekularnej;jednak połączenie kulek magnetycznych z mikroprzepływami nadal w dużej mierze opiera się na złożonych systemach sterowania do precyzyjnej manipulacji kulkami magnetycznymi, co tłumaczy popularność produktów komercyjnych, które są nieporęczne i drogie, co ogranicza dalsze zastosowanie kulek magnetycznych w POCT.
Do wykrywania kwasów nukleinowych wykorzystano również kilka materiałów porowatych, takich jak zmodyfikowane filtry nitrocelulozowe, karty Finders Technology Associates (FTA), bibuły filtracyjne na bazie polieterosulfonu oraz materiały powlekane glikanami [40, 41, 42, 43, 44].Porowate materiały włókniste, takie jak papier włóknisty, zostały po raz pierwszy użyte do izolacji DNA poprzez fizyczne splątanie długoniciowych cząsteczek DNA z włóknami.Małe pory prowadzą do silnego fizycznego ograniczenia cząsteczek DNA, co pozytywnie wpływa na ekstrakcję DNA.Ze względu na różne rozmiary porów papieru włóknistego wydajność ekstrakcji nie może zaspokoić potrzeb amplifikacji DNA [45, 46].Karta FTA to komercyjna bibuła filtracyjna stosowana w dziedzinie medycyny sądowej i szeroko stosowana w innych obszarach diagnostyki molekularnej.Dzięki zastosowaniu celulozowej bibuły filtracyjnej impregnowanej różnymi chemikaliami do lizy błon komórkowych w próbce, uwolniony DNA jest chroniony przed degradacją przez okres do 2 lat.Niedawno opracowano impregnowany papier celulozowy do molekularnego wykrywania różnych patogenów, w tym SARS-CoV-2, leiszmaniozy i malarii [47,48,49].HIV w wyizolowanym osoczu ulega bezpośredniej lizie, a wirusowy kwas nukleinowy jest wzbogacany w membranę przepływową FTA® wbudowaną w koncentrator, co umożliwia wydajną produkcję kwasu nukleinowego [50] (ryc. 2c).Głównym problemem związanym z wykrywaniem kwasów nukleinowych za pomocą kart FTA jest to, że substancje chemiczne, takie jak guanidyna i izopropanol, hamują późniejsze reakcje amplifikacji.Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy bibułę filtracyjną Fusion 5 modyfikowaną chitozanem, która łączy zalety zarówno fizycznego przeplatania cząsteczek DNA i włóknistej bibuły filtracyjnej, jak i elektrostatycznej adsorpcji DNA na związkach modyfikowanych chitozanem w celu uzyskania wysoce wydajnej ekstrakcji kwasu nukleinowego ..włókna filtracyjne [51] (rys. 2d).Podobnie Zhu i in.[52] wykazali zmodyfikowaną chitozanem metodę PCR opartą na kapilarnym układzie mikroprzepływowym in situ do szybkiej izolacji i wykrywania RNA wirusa Zika.Kwasy nukleinowe mogą być adsorbowane/desorbowane odpowiednio w mieszanym podłożu lizat/PCR, w oparciu o właściwość włączania/wyłączania chitozanu.włączanie i wyłączanie”, reagujące na pH.
Jak wspomniano powyżej, strategie te łączą zalety różnych materiałów fazy stałej i zwiększają wydajność ekstrakcji kwasów nukleinowych w mikroprzepływach.W zastosowaniach praktycznych stosowanie tych materiałów w dużych ilościach jest nieekonomiczne, a odpowiednia obróbka powierzchni lub modyfikacja powierzchni powszechnych materiałów tymi materiałami może również zachować ich funkcję.Dlatego uważa się, że wdrożenie tych strategii po przeprowadzeniu badania pilotażowego może obniżyć koszty.
Badanie kwasów nukleinowych na platformach mikroprzepływowych często wykorzystuje małe objętości próbek (<100 µl), dlatego wymaga amplifikacji docelowych kwasów nukleinowych za pomocą specyficznych sond do konwersji na sygnał, który jest wygodny do późniejszej detekcji (optyczny, elektryczny i magnetyczny) [53, 54]. Badanie kwasów nukleinowych na platformach mikroprzepływowych często wykorzystuje małe objętości próbek (<100 µl), dlatego wymaga amplifikacji docelowych kwasów nukleinowych za pomocą specyficznych sond do konwersji na sygnał, który jest wygodny do późniejszej detekcji (optyczny, elektryczny i magnetyczny) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Podczas testowania kwasów nukleinowych na platformach mikroprzepływowych często stosuje się próbki o małych objętościach (<100 µl), dlatego wymagana jest amplifikacja docelowych kwasów nukleinowych za pomocą specjalnych sond w celu przekształcenia go w sygnał dogodny do późniejszej detekcji (optyczny, elektryczny i magnetyczny) [53, 54].微流控平台上的核酸检测通常使用小样本量（< 100 µl），因此需要使用特定探针扩增目标核酸，以转换为便于下游检测（光学、电学和磁学）的信号[53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Detekcja kwasów nukleinowych na platformach mikroprzepływowych zwykle wykorzystuje małe objętości próbek (<100 μl), co wymaga amplifikacji docelowych kwasów nukleinowych specjalnymi sondami w celu przekształcenia ich w sygnały do późniejszej detekcji (optycznej, elektrycznej i magnetycznej) [53, 54]] .Amplifikacja kwasu nukleinowego w mikroprzepływach może również przyspieszyć reakcje, zoptymalizować granice wykrywalności, zmniejszyć wymagania dotyczące próbek i poprawić dokładność wykrywania [55, 56].W ostatnich latach, wraz z realizacją szybkiej i dokładnej detekcji, w mikroprzepływach zastosowano różne metody amplifikacji kwasów nukleinowych, w tym PCR i niektóre reakcje amplifikacji izotermicznej.Ta sekcja zawiera podsumowanie metod wykrywania kwasów nukleinowych w oparciu o systemy mikroprzepływowe.
PCR to symulacja procesu replikacji DNA organizmu, której teoria została szczegółowo opisana w innym miejscu i nie będzie tutaj omawiana.PCR może amplifikować bardzo małą ilość docelowego DNA/RNA w tempie wykładniczym, dzięki czemu PCR jest potężnym narzędziem do szybkiego wykrywania kwasów nukleinowych.W ostatnich dziesięcioleciach opracowano wiele przenośnych urządzeń mikroprzepływowych wyposażonych w systemy cykli termicznych PCR, aby sprostać potrzebom diagnostyki przychodni [57, 58].PCR on-chip można podzielić na cztery typy (konwencjonalny, ciągły, z przełączaniem przestrzennym i konwekcyjny) według różnych metod kontroli temperatury [59].Na przykład Gee i in.[60] opracowali bezpośrednią metodę ilościowej odwrotnej transkrypcji PCR (RT-qPCR) na własnej platformie mikroprzepływowej do wykrywania multipleksów SARS-CoV-2, wirusów grypy A i B w próbkach wymazu z gardła (ryc. 3a).Park i in.[61] zbudowali prosty chip do analizy patogenów, integrując cienkowarstwowy PCR, elektrody i obsługiwany palcem moduł mikroprzepływowy oparty na polidimetylosiloksanie.Jednak obie prace ucieleśniają wspólne wady konwencjonalnego PCR.PCR wymaga cykli termicznych, co ogranicza dalszą miniaturyzację urządzenia i skrócenie czasu testowania.
Rozwój mikrocieczowego i komutowanego w przestrzeni PCR opartego na ciągłym przepływie ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania tego problemu.Używając długiego kanału serpentynowego lub krótkiego prostego kanału, PCR z ciągłym przepływem może zapewnić szybką amplifikację dzięki aktywnej cyrkulacji odczynników w trzech strefach wstępnego podgrzewania za pomocą pompy off-chip.Operacja ta skutecznie omija fazę przejściową pomiędzy różnymi temperaturami reakcji, a tym samym znacznie skraca czas badania [62] (rys. 3b).W innym badaniu Junga i in.[63] zaproponowali nowy rotacyjny analizator genetyczny PCR, który łączy cechy utrwalonej i przepływowej PCR dla ultraszybkiego i multipleksowego PCR z odwrotną transkrypcją (ryc. 3c).W celu amplifikacji kwasu nukleinowego mikrochip PCR będzie obracany przez trzy bloki grzewcze w różnych temperaturach: 1. Blok denaturacji 94°C, 2. Blok hybrydyzacji w 58°C, 3. Blok ekspansji w 72°C.
Zastosowanie PCR w mikroprzepływach.Schematyczne przedstawienie dirRT-qPCR na platformie mikroprzepływowej (na podstawie [60]).b Schematyczne przedstawienie mikromacierzy PCR z ciągłym przepływem opartej na kanale serpentynowym (zaadaptowane z [62]).c Schematyczne przedstawienie obrotowego analizatora genetycznego PCR, składającego się z mikroczipa, trzech bloków grzewczych i silnika krokowego (na podstawie [63]).d Schemat termokonwekcji PCR z wirowaniem i konfiguracją (na podstawie [64]).DirRT-qPCR, bezpośrednia ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją
Wykorzystując kapilary i pętle, a nawet cienkie płytki, konwekcyjny PCR może szybko amplifikować kwasy nukleinowe poprzez naturalną swobodną konwekcję termiczną bez potrzeby stosowania zewnętrznej pompy.Na przykład platforma mikroprzepływowa z cyklicznego polimeru olefinowego została opracowana na wytworzonym obrotowym etapie grzewczym, który wykorzystuje cykl termiczny z wirowaniem w mikrokanale pętli PCR [64] (rys. 3d).Roztwór reakcyjny jest napędzany konwekcją termiczną, która w sposób ciągły wymienia wysoką i niską temperaturę w mikrokanale o strukturze pierścieniowej.Cały proces amplifikacji można zakończyć w 10 minut przy granicy wykrywalności 70,5 pg/kanał.
Zgodnie z oczekiwaniami, szybki PCR jest potężnym narzędziem do w pełni zintegrowanych systemów diagnostyki molekularnej odpowiedzi próbki i analizy multipleksowej.Rapid PCR znacznie skraca czas potrzebny do wykrycia SARS-CoV-2, co przyczynia się do skutecznej kontroli pandemii COVID-19.
PCR wymaga złożonego termocyklera, który nie jest odpowiedni do POCT.Ostatnio techniki amplifikacji izotermicznej zastosowano w mikroprzepływach, w tym między innymi LAMP, amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) i amplifikację opartą na sekwencjach kwasów nukleinowych [65,66,67,68].Dzięki tym technikom kwasy nukleinowe są amplifikowane w stałej temperaturze, co ułatwia tworzenie tanich, wysoce czułych przenośnych urządzeń POCT do diagnostyki molekularnej.
Wysokowydajne testy LAMP oparte na mikroprzepływach umożliwiają wielokrotne wykrywanie chorób zakaźnych [42, 69, 70, 71].W połączeniu z wirówkowym systemem mikroprzepływowym, LAMP może dodatkowo ułatwić automatyzację wykrywania kwasów nukleinowych [69, 72, 73, 74, 75].Spin-and-react SlipChip został opracowany do wizualnego wykrywania wielu równoległych bakterii przy użyciu LAMP [76] (ryc. 4a).Przy użyciu zoptymalizowanej LAMP w teście, stosunek sygnału fluorescencji do szumu był około 5-krotny, a granica wykrywalności osiągnęła 7,2 kopii/μl genomowego DNA. Ponadto metodą w czasie < 60 min uwidoczniono obecność pięciu powszechnych bakteryjnych patogenów przewodu pokarmowego, w tym Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis i Vibrio parahaemolyticus. Ponadto metodą w czasie < 60 min uwidoczniono obecność pięciu powszechnych bakteryjnych patogenów przewodu pokarmowego, w tym Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis i Vibrio parahaemolyticus.Ponadto w czasie krótszym niż 60 minut uwidoczniono obecność pięciu powszechnych patogenów bakteryjnych przewodu pokarmowego, w tym Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis i Vibrio parahaemolyticus.此外，基于该方法在<60分钟内可视化了五种常见消化道细菌病原体的存在，包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、河流弧菌和副溶血性弧菌。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 的 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血性。。。 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPPonadto w czasie krótszym niż 60 minut uwidoczniono obecność pięciu powszechnych patogenów bakteryjnych przewodu pokarmowego, w tym Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius i Vibrio parahaemolyticus.
Zaletami LAMP w mikroprzepływach są m.in. szybka reakcja i zminiaturyzowane wykrywanie.Jednak ze względu na temperaturę reakcji (około 70°C) podczas LAMP nieuchronnie powstają aerozole, co skutkuje wysokim odsetkiem wyników fałszywie dodatnich.Specyficzność testu, projekt podkładu i kontrola temperatury również muszą być zoptymalizowane pod kątem LAMP.Ponadto projekty chipów, które implementują wykrywanie wielu celów na jednym chipie, mają wielką wartość i powinny być rozwijane.Ponadto LAMP nadaje się do wykrywania wielozadaniowego zintegrowanego w jednym chipie, co ma ogromne znaczenie, ale wciąż jest dużo miejsca na rozwój.
Wysoki wskaźnik wyników fałszywie pozytywnych LAMP można częściowo zmniejszyć za pomocą RPA, ponieważ stosunkowo niska temperatura reakcji (~37 °C) powoduje stosunkowo niewiele problemów z parowaniem [77].W systemie RPA dwa przeciwstawne startery inicjują syntezę DNA poprzez wiązanie się z rekombinazą, a amplifikacja może zostać zakończona w ciągu 10 minut [78,79,80,81].Dlatego cały proces RPA jest znacznie szybszy niż PCR czy LAMP.W ostatnich latach wykazano, że technologia mikroprzepływowa jeszcze bardziej poprawia szybkość i dokładność RPA [82,83,84].Na przykład Liu i in.[85] opracowali mikroprzepływowy, zintegrowany test amplifikacji polimerazy z rekombinazami o przepływie bocznym do szybkiego i czułego wykrywania SARS-CoV-2 poprzez integrację RPA z odwrotną transkrypcją (RT-RPA) i uniwersalny system wykrywania pasków testowych z przepływem bocznym.w jeden system mikroprzepływowy.Rysunek 4b).Granica wykrywalności wynosi 1 kopia/µl lub 30 kopii/próbkę, a wykrywanie można zakończyć w około 30 minut.Kong i in.opracowali nadające się do noszenia urządzenie mikroprzepływowe.[86] wykorzystali temperaturę ciała i system wykrywania fluorescencji oparty na telefonie komórkowym, aby szybko i bezpośrednio wykryć DNA wirusa HIV-1 za pomocą RPA (ryc. 4c).Test RPA do noszenia wykrywa 100 kopii/ml sekwencji docelowej w ciągu 24 minut, wykazując ogromny potencjał do szybkiej diagnozy niemowląt zakażonych HIV-1 w warunkach ograniczonych zasobów.
Amplifikacja izotermiczna w testach przyłóżkowych (POCT).Opracowanie i produkcja spinu i reakcji SlipChip.Po spawaniu plazmowym wióry górny i dolny zmontowano za pomocą zestawu nakrętek, tworząc chip końcowy (na podstawie [76]).b Schemat systemu MI-IF-RPA do wykrywania COVID-19 (na podstawie [85]).c Schemat noszonego testu RPA do szybkiego wykrywania DNA HIV-1 (na podstawie [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboksyfluoresceina, ludzki wirus niedoboru odporności HIV, amplifikacja polimerazy rekombinazy RPA, dioda elektroluminescencyjna LED, MI-IF-RPA Rekombinacja mikrofluidazy z przepływem bocznym Wzmocnienie
RPA oparte na mikroprzepływach szybko się rozwija, jednak koszty wytwarzania chipów i zużycia reakcji są zbyt wysokie i muszą zostać obniżone, aby zwiększyć dostępność tej technologii.Ponadto wysoka czułość RPA może wpływać na amplifikację niespecyficznych produktów, zwłaszcza w obecności zanieczyszczenia.Ograniczenia te mogą mieć wpływ na zastosowanie RPA w układach mikroprzepływowych i zasługują na dalszą optymalizację.Potrzebne są również dobrze zaprojektowane startery i sondy dla różnych celów, aby poprawić wykonalność strategii mikroprzepływowych opartych na RPA w POCT.
Cas13 i Cas12a mają zdolność losowego rozszczepiania kwasów nukleinowych, a zatem mogą być opracowane jako narzędzia do wykrywania i diagnostyki.Cas13 i Cas12a są aktywowane po związaniu odpowiednio z docelowym DNA lub RNA.Po aktywacji białko zaczyna rozszczepiać inne pobliskie kwasy nukleinowe, po czym kierujące RNA ukierunkowane na kwasy nukleinowe specyficzne dla patogenu mogą rozszczepiać wygaszone sondy fluorescencyjne i uwalniać fluorescencję.W oparciu o tę teorię Kellner i in.[87] opracowali metodę opartą na Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], a Broughton i in.[88] opracowali inne podejście oparte na Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuklease (DTECR)].
W ostatnich latach pojawiły się różne metody wykrywania kwasów nukleinowych oparte na CRISPR [89, 90].Konwencjonalne metody oparte na CRISPR są często czasochłonne i pracochłonne ze względu na wiele procedur, w tym ekstrakcję kwasów nukleinowych, amplifikację i wykrywanie CRISPR.Ekspozycja płynów na powietrze może zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania wyników fałszywie dodatnich.Biorąc pod uwagę powyższe, systemy oparte na CRISPR pilnie wymagają optymalizacji.
Do zastosowań w detekcji CRISPR-Cas12a i CRISPR-Cas13a opracowano pneumatycznie sterowaną platformę mikroprzepływową, która może wykonywać równolegle 24 analizy [91].System jest wyposażony w urządzenie do wykrywania fluorescencji, które omija amplifikację kwasu nukleinowego i automatycznie wykrywa próbki femtomoliowego DNA i RNA.Chen i in.[92] zintegrowali amplifikację rekombinazy z systemem CRISPR-Cas12a w mikroprzepływach wirówkowych (ryc. 5a).Praca ta przezwycięża trudność integracji tych dwóch procesów, ponieważ Cas12a może trawić DNA informacyjne i hamować proces amplifikacji.Ponadto Chen i in.[92] dodatkowo wstępnie przechowywali odczynniki reakcji w odśrodkowym mikroprzepływowym układzie kontrolnym, aby automatycznie zakończyć cały proces.W innej pracy Silva i in.[93] opracowali metodę diagnostyczną bez amplifikacji CRISPR/Cas12a i smartfona do wykrywania SARS-CoV-2 (ryc. 5b).Test ten, znany jako system bez amplifikacji oparty na telefonie komórkowym, obejmuje enzym zależny od CRISPR/Cas, który opiera się na wizualizacji przez smartfona sygnałów pęcherzyków generowanych przez katalazę w kanałach mikroprzepływowych.Czułe wykrywanie mniej niż 50 kopii/µl kwasu nukleinowego bez wstępnej amplifikacji, cały proces od wstrzyknięcia próbki do odczytu sygnału zajmuje tylko 71 minut.
Metody wykrywania kwasów nukleinowych oparte na CRISPR.Odśrodkowa POCT do zintegrowanej diagnostyki molekularnej opartej na CRISPR (na podstawie [92]).b Opracowanie testu CASCADE do analizy SARS-CoV-2 w oparciu o smartfony (na podstawie [93]).Amplifikacja rekombinazy RAA, sąsiadujący motyw protoprzerywnika PAM, zgrupowane krótkie palindromiczne powtórzenia CRISPR w regularnych odstępach czasu, system CASCADE bez amplifikacji telefonu komórkowego z enzymami CRISPR/CAS, chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodiimidu EDC
Jako ostatni krok w wykrywaniu kwasów nukleinowych, wykrywanie sygnału bezpośrednio odzwierciedla wyniki diagnostyczne i jest krytycznym czynnikiem w rozwoju wydajnej, czułej i dokładnej POCT.Sygnały można odczytywać różnymi metodami, takimi jak strategie fluorescencyjne, elektrochemiczne, kolorymetryczne i magnetyczne.W tej części opisujemy uzasadnienie dla każdego podejścia i porównujemy diagnostykę molekularną chorób zakaźnych w mikroprzepływach.
Strategie oparte na fluorescencji są szeroko stosowane w diagnostyce POCT chorób zakaźnych ze względu na ich niezwykłe zalety, takie jak doskonała czułość, niski koszt, łatwość obsługi i analiza w miejscu opieki [94, 95].Strategie te wykorzystują znakowane fluorofory, takie jak barwniki fluorescencyjne i nanomateriały, w celu wytworzenia wykrywalnego sygnału (wzmocnienie lub wygaszenie fluorescencji).To odkrycie sugeruje, że strategie oparte na fluorescencji można podzielić na bezpośrednie znakowanie fluorescencyjne, wykrywanie fluorescencji z włączeniem i wyłączeniem sygnału [96].Bezpośrednie wykrywanie znaczników fluorescencyjnych wykorzystuje specjalne znaczniki fluorescencyjne do znakowania specyficznych ligandów, które generują określoną ilość fluorescencji po selektywnym związaniu z celem.W przypadku detekcji fluorescencji opartej na sygnale, jakość sygnału fluorescencyjnego jest dodatnio związana z wielkością zainteresowania.Intensywność fluorescencji jest pomijalna przy braku celu i jest wykrywalna, gdy obecna jest wystarczająca ilość celu.Odwrotnie, intensywność fluorescencji wykrytej przez fluorescencję „sygnałową” jest odwrotnie proporcjonalna do ilości celu, początkowo osiągając maksymalną wartość i stopniowo zmniejszając się w miarę powiększania się celu.Na przykład, stosując mechanizm cięcia trans CRISPR-Cas13a zależny od celu, Tian et al.[97] opracowali nową strategię rozpoznawania do wykrywania RNA, które bezpośrednio omijają odwrotną transkrypcję (ryc. 6a).Po związaniu się z komplementarnymi docelowymi RNA, kompleks CRISPR-Cas13-RNA może zostać aktywowany, wywołując cięcie transkolateralne przez niespecyficzne reporterowe RNA.Znakowany fluorescencyjnie reporter [fluorofor (F)] jest wygaszany przez wygaszacz (Q) w stanie nienaruszonym i fluoryzuje po rozszczepieniu przez aktywowany kompleks.
Zaletą wykrywania elektrochemicznego jest duża szybkość wykrywania, łatwa produkcja, niski koszt, łatwość przenoszenia i automatyczna kontrola.Jest to potężna metoda analityczna do zastosowań POCT.W oparciu o grafenowe tranzystory polowe Gao et al.[98] opracowali nanobiosensor do multipleksowej detekcji antygenów boreliozy z bakterii Borrelia burgdorferi z limitem detekcji 2 pg/ml (ryc. 6b).
Testy kolorymetryczne były wykorzystywane w aplikacjach POCT, czerpiąc korzyści z zalet przenoszenia, niskich kosztów, łatwości przygotowania i odczytu wizualnego.Detekcja kolorymetryczna może wykorzystywać utlenianie peroksydazy lub nanomateriałów peroksydazopodobnych, agregację nanomateriałów oraz dodatek barwników wskaźnikowych w celu przekształcenia informacji o obecności docelowych kwasów nukleinowych na widoczne zmiany koloru [99, 100, 101].Warto zauważyć, że nanocząstki złota są szeroko stosowane w opracowywaniu strategii kolorymetrycznych, a ze względu na ich zdolność do wywoływania szybkich i znaczących zmian koloru, rośnie zainteresowanie rozwojem platform kolorymetrycznych POCT do diagnostyki chorób zakaźnych in situ [102].Dzięki zintegrowanemu odśrodkowemu urządzeniu mikroprzepływowemu [103] patogeny przenoszone przez żywność w zanieczyszczonych próbkach mleka mogą być automatycznie wykrywane na poziomie 10 komórek bakteryjnych, a wyniki można odczytać wizualnie w ciągu 65 minut (ryc. 6c).
Techniki wykrywania magnetycznego umożliwiają dokładne wykrywanie analitów przy użyciu materiałów magnetycznych, aw ostatnich dziesięcioleciach pojawiło się duże zainteresowanie zastosowaniami POCT.Techniki wykrywania magnetycznego mają pewne wyjątkowe zalety, takie jak tanie materiały magnetyczne zamiast drogich komponentów optycznych.Jednak zastosowanie pola magnetycznego poprawia skuteczność detekcji i skraca czas przygotowania próbki [104].Ponadto wyniki sondowania magnetycznego wykazują wysoką swoistość, czułość i wysoki stosunek sygnału do szumu ze względu na nieznaczny sygnał tła magnetycznego próbek biologicznych [105].Sharma i in.zintegrował bioczujnik oparty na złączu tunelowym magnetycznym z przenośną platformą mikroprocesorową.[106] do multipleksowego wykrywania patogenów (ryc. 6d).Bioczujniki z czułością wykrywają subnanomolowe kwasy nukleinowe wyizolowane z patogenów.
Typowa metoda wykrywania sygnału.Koncepcja hiperlokalizacji wykrywania Cas13a (zaadaptowana z [97]).b Nanobiosensor grafenowy FET w połączeniu z Lyme GroES scFv (na podstawie [98]).c Wskazania kolorymetryczne do multipleksowej detekcji patogenów przenoszonych przez żywność w wirówkowym chipie mikroprzepływowym: próbki nr 1 i nr 3 z patogenami docelowymi oraz próbki nr 2, nr 4 i nr 5 bez patogenów docelowych (na podstawie [103]) .d Biosensor oparty na magnetycznym złączu tunelowym, zawierający platformę, wbudowany wzmacniacz blokujący, jednostkę sterującą i zasilacz do generowania/akwizycji sygnału (na podstawie [106]).GFET Grafen FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimetikon, polimetakrylan metylu PMMA
Pomimo doskonałych właściwości powyższych metod wykrywania, nadal mają one wady.Metody te są porównywane (tabela 1), w tym niektóre aplikacje ze szczegółami (za i przeciw).
Wraz z rozwojem mikroprzepływów, układów mikroelektromechanicznych, nanotechnologii i materiałoznawstwa, zastosowanie chipów mikroprzepływowych do wykrywania chorób zakaźnych stale się rozwija [55,96,107,108].Precyzyjne manipulowanie miniaturowym sprzętem i płynami przyczynia się do dokładności diagnostycznej i opłacalności.Dlatego w celu dalszego rozwoju podjęto wysiłki w celu optymalizacji i modernizacji chipów, co zaowocowało różnymi chipami mikroprzepływowymi o różnych strukturach i funkcjach.Tutaj pokrótce przedstawiamy kilka popularnych typów platform mikroprzepływowych i porównujemy ich cechy (za i przeciw).Ponadto większość wymienionych poniżej przykładów koncentruje się przede wszystkim na zwalczaniu SARS-CoV-2.
LOCC są najpowszechniejszymi zminiaturyzowanymi złożonymi systemami analitycznymi, a ich działania są wysoce zminiaturyzowane, zintegrowane, zautomatyzowane i zrównoleglone, począwszy od wstrzykiwania i przygotowania próbki, kontroli przepływu i detekcji cieczy [109, 110].Płynami manipuluje się poprzez starannie zaprojektowaną geometrię i interakcję wielu efektów fizycznych, takich jak gradienty ciśnienia, działanie kapilarne, elektrodynamika, pola magnetyczne i fale akustyczne [111].LOCC wykazuje doskonałe zalety w wysokoprzepustowym przeszukiwaniu i wielokrotnym wykrywaniu, z dużą szybkością analizy, małym rozmiarem próbki, niskim zużyciem energii oraz wysoką wydajnością zarządzania i obsługi;jednak urządzenia LOCC są bardzo delikatne, a ich produkcja, pakowanie i interfejs.Jednak multipleksowanie i ponowne wykorzystanie napotykają ogromne trudności [96].W porównaniu z innymi platformami, LOCC ma wyjątkowe zalety pod względem maksymalnej różnorodności aplikacji i najlepszej kompatybilności technologicznej, ale jego wady są również oczywiste, a mianowicie duża złożoność i słaba powtarzalność.Zależność od pomp zewnętrznych, które często są nieporęczne i drogie, dodatkowo ogranicza ich zastosowanie w POCT.
Podczas epidemii COVID-19 LOCC cieszył się dużym zainteresowaniem.Jednocześnie pojawiło się kilka nowych chipów, które łączą kilka technologii.Na przykład smartfony są obecnie szeroko stosowane jako przenośne urządzenia analityczne i mają ogromny potencjał do integracji z LOCC.Sun i in.[21] wyprodukowali mikroprzepływowy chip, który umożliwia multipleksowanie określonych sekwencji kwasów nukleinowych pięciu patogenów, w tym SARS-CoV-2, przy użyciu LAMP i analizowali je przy użyciu smartfona w ciągu 1 godziny po zakończeniu reakcji.Jako inny przykład, Sundah i in.[112] stworzyli przełącznik molekularny [amplifikacja katalityczna przez przełącznik stanu przejścia molekularnego (CATCH)] do bezpośredniego i czułego wykrywania celów RNA SARS-CoV-2 za pomocą smartfonów. CATCH jest kompatybilny z przenośnym LOCC i osiąga doskonałą wydajność (około 8 kopii RNA/μl; < 1 h w temperaturze pokojowej) [112]. CATCH jest kompatybilny z przenośnym LOCC i osiąga doskonałą wydajność (około 8 kopii RNA/μl; < 1 h w temperaturze pokojowej) [112]. CATCH совместим спортативным LOCC i обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копий РНК/комплет) [12] CATCH jest kompatybilny z przenośnym LOCC i zapewnia doskonałą przepustowość (około 8 kopii RNA/µl; < 1 hw temperaturze pokojowej) [112]. POŁÓW 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下<1 小时）[112]。 POŁÓW 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下<1 小时）[112]。 CATCH совместим спортативными LOCC i обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мклстим) [12] CATCH jest kompatybilny z przenośnymi LOCC i ma doskonałą wydajność (około 8 kopii RNA/µl; < 1 godzina w temperaturze pokojowej) [112].Ponadto urządzenia LOCC do diagnostyki molekularnej wykorzystują również pewne siły napędowe, takie jak podciśnienie, rozciąganie i pola elektryczne.Kang i in.[113] zademonstrowali ultraszybką reakcję PCR w czasie rzeczywistym z nanoplazmą na chipie do szybkiej i ilościowej diagnozy COVID-19 w terenie przy użyciu układu próżniowego plazmonicznego ciekłego układu PCR.Li i in.[114] następnie opracowali mikroprzepływowy chip z rozciąganiem, który umożliwił diagnozę COVID-19.Platforma wykorzystuje system amplifikacji RT-LAMP w celu określenia, czy próbka jest jakościowo pozytywna czy negatywna.Następnie Ramachandran i in.[115] osiągnęli odpowiednie gradienty pola elektrycznego za pomocą izotachoforezy (ITP), techniki selektywnego skupiania jonów wdrożonej w mikroprzepływach.Dzięki ITP docelowy RNA z surowych próbek wymazów z nosogardzieli może zostać automatycznie oczyszczony.Następnie Ramachandran i in.[115] Łącząc to oczyszczanie ITP z testami LAMP i CRISPR wzmocnionymi ITP wykryto SARS-CoV-2 w wymazach z nosogardzieli i próbkach klinicznych w ciągu około 35 minut.Ponadto stale pojawiają się nowe pomysły.Jadhav i in.[116] zaproponowali schemat diagnostyczny oparty na wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana w połączeniu z urządzeniem mikroprzepływowym zawierającym pionowo zorientowane nanorurki węglowe pokryte złotem/srebrem lub jednorazowe mikro/nanorurki elektroprzędzone.Wbudowane mikrokanały filtrujące z funkcją membrany są jednorazowego użytku.Urządzenie adsorbuje wirusy z różnych płynów ustrojowych/wysięków, takich jak ślina, nosogardło i łzy.Zatem miano wirusa jest obfite i wirus może być dokładnie zidentyfikowany na podstawie sygnatury Ramana.
LOAD to odśrodkowa platforma mikroprzepływowa, w której wszystkie procesy są kontrolowane przez protokół częstotliwości, który obraca podłoże o mikrostrukturze [110].Urządzenie LOAD charakteryzuje się wykorzystaniem siły odśrodkowej jako ważnej siły napędowej.Ciecze podlegają również siłom kapilarnym, Eulera i Coriolisa.Za pomocą urządzenia wirówkowego analizy są wykonywane w trybie ciągłym w płynie od położenia promieniowego do wewnątrz do położenia na zewnątrz, eliminując potrzebę stosowania dodatkowych zewnętrznych przewodów rurowych, pomp, siłowników i aktywnych zaworów.Krótko mówiąc, jedna metoda sterowania upraszcza obsługę.Siły działające na ciecz w tym samym kanale mikroprzepływowym w tej samej odległości od środka obciążenia są równe, co pozwala na powtórzenie struktury kanału.Tak więc sprzęt LOAD jest prostszy i bardziej ekonomiczny w projektowaniu i produkcji niż konwencjonalne urządzenia LOCC, podczas gdy reakcje są w dużej mierze niezależne i równoległe;jednak ze względu na wysoką wytrzymałość mechaniczną urządzeń odśrodkowych, dostępny materiał wiórów jest ograniczony, a małe objętości są trudne.do samochodu.Jednocześnie większość urządzeń LOAD jest zaprojektowana wyłącznie do jednorazowego użytku, co jest kosztowne w przypadku detekcji na dużą skalę [96, 117, 118, 119].
W ostatnich dziesięcioleciach LOAD, uważane za jedno z najbardziej obiecujących urządzeń mikroprzepływowych, cieszy się dużym zainteresowaniem badaczy i producentów.Tym samym LOAD zyskał szeroką akceptację i został wykorzystany do diagnostyki molekularnej patogenów zakaźnych [120, 121, 122, 123, 124], zwłaszcza podczas epidemii COVID-19.Na przykład pod koniec 2020 r. Ji i in.[60] wykazali bezpośredni test RT-qPCR do szybkiego i automatycznego równoległego wykrywania infekcji SARS-CoV-2 i grypy A i B w wymazach z gardła.Następnie Xiong i in.[74] zaprezentowali zintegrowaną z LAMP platformę mikroprzepływów dyskoidalnych do szybkiego, dokładnego i jednoczesnego wykrywania siedmiu ludzkich koronawirusów układu oddechowego, w tym SARS-CoV-2, w ciągu 40 minut.Na początku 2021 r. de Oliveira i in.[73] zademonstrowali odśrodkowy mikroprzepływowy chip polistyrenowy z tonerem, obsługiwany ręcznie za pomocą rotatora opuszka palca, do diagnostyki molekularnej COVID-19 metodą RT-LAMP.Następnie Dignan i in.[39] zaprezentowali zautomatyzowane przenośne urządzenie wirówkowe do oczyszczania SARS-CoV-2 RNA bezpośrednio z wycinków wymazów policzkowych.Medved i in.[53] zaproponowali wbudowany system pobierania próbek aerozolu SARS-CoV-2 z obrotowym mikroprzepływowym chipem fluorescencyjnym o małej objętości z limitem wykrywalności 10 kopii/μl i minimalnym progiem cyklu wynoszącym 15 minut.Suarez i in.[75] niedawno donieśli o opracowaniu zintegrowanej modułowej wirówkowej platformy mikroprzepływowej do bezpośredniego wykrywania SARS-CoV-2 RNA w inaktywowanych termicznie próbkach wymazów z nosogardzieli przy użyciu LAMP.Te przykłady pokazują ogromne korzyści i obietnicę LOAD w diagnostyce molekularnej COVID-19.
W 1945 roku Muller i Clegg [125] po raz pierwszy przedstawili mikroprzepływowe kanały na papierze z użyciem bibuły filtracyjnej i parafiny.W 2007 roku grupa Whitesides [126] stworzyła pierwszą funkcjonalną platformę papierową do testowania białek i glukozy.Papier stał się idealnym podłożem dla mikroprzepływów.Papier posiada nieodłączne właściwości, takie jak hydrofilowość i porowata struktura, doskonała biokompatybilność, lekkość, elastyczność, podatność na zginanie, niski koszt, łatwość użytkowania i wygoda.Klasyczne µPADy składają się z hydrofilowych/hydrofobowych struktur zbudowanych na podłożach papierowych.W zależności od trójwymiarowej struktury, μPAD można podzielić na dwuwymiarowe (2D) i trójwymiarowe (3D) μPADs.2D µPADs są wytwarzane przez tworzenie hydrofobowych granic w celu utworzenia kanałów mikroprzepływowych, podczas gdy 3D µPADs są zwykle wytwarzane ze stosów warstw dwuwymiarowego papieru mikroprzepływowego, czasami poprzez składanie papieru, techniki poślizgu, otwarte kanały i drukowanie 3D [96].Płyny wodne lub biologiczne na urządzeniu μPAD są przede wszystkim kontrolowane przez siłę kapilarną bez zewnętrznego źródła zasilania, co ułatwia wstępne przechowywanie odczynników, obsługę próbek i detekcję multipleksową.Jednak dokładna kontrola przepływu i detekcja multipleksu są utrudnione przez niewystarczającą szybkość wykrywania, czułość i możliwość ponownego użycia [96, 127, 128, 129, 130].
Jako niezwykła platforma mikroprzepływowa, μPAD jest szeroko promowana i rozwijana do diagnostyki molekularnej chorób zakaźnych, takich jak HCV, HIV i SARS-CoV-2 [131, 132].Do selektywnego i czułego wykrywania HCV Tengam et al.[133] opracowali nowy bioczujnik oparty na papierze fluorescencyjnym, wykorzystujący wysoce specyficzną sondę kwasu nukleinowego opartą na peptydzie pirolidynylowym.Kwasy nukleinowe są kowalencyjnie unieruchamiane na częściowo utlenionej bibule celulozowej poprzez redukcyjne alkilowanie pomiędzy grupami aminowymi i aldehydowymi, a detekcja opiera się na fluorescencji.Sygnały te można odczytać za pomocą specjalnie wykonanego gadżetu z przenośną kamerą fluorescencyjną w połączeniu z kamerą telefonu komórkowego.Następnie Lu i in.[134] zaprojektowali elastyczną elektrodę opartą na papierze na bazie nanocząstek niklu/złota/nanorurki węglowe/polialkohol winylowy z metaloorganicznymi kompozytami ramowymi do wykrywania celu HIV przez hybrydyzację DNA z użyciem błękitu metylenowego jako wskaźnika redoks DNA.Niedawno Chowdury i in.[135] przedstawili hipotetyczny projekt platformy do punktowego testowania µPAD przy użyciu surowej śliny pacjenta w połączeniu z LAMP i przenośną technologią obrazowania do wykrywania analitów COVID-19.
Testy przepływu bocznego kierują płynami za pomocą sił kapilarnych i kontrolują ruch płynu za pomocą zwilżalności i właściwości podłoży porowatych lub mikrostrukturalnych.Urządzenia z przepływem bocznym składają się z próbki, koniugatu, inkubatora i detektora oraz podkładek absorpcyjnych.Cząsteczki kwasu nukleinowego w LFA rozpoznają specyficzne wiązania, które są wstępnie przechowywane w miejscu wiązania i wiążą się jako kompleksy.Gdy ciecz przechodzi przez płytki inkubacyjne i detekcyjne, kompleksy są wychwytywane przez cząsteczki wychwytujące znajdujące się na liniach testowych i kontrolnych, dając wyniki, które można odczytać bezpośrednio gołym okiem.Zazwyczaj LFA można ukończyć w 2-15 minut, czyli szybciej niż tradycyjne odkrycie.Dzięki specjalnemu mechanizmowi LFA wymaga niewielu operacji i nie wymaga dodatkowego wyposażenia, co czyni go bardzo przyjaznym dla użytkownika.Jest łatwy w produkcji i miniaturyzacji, a koszt podłoży papierowych jest niższy.Jednak jest on używany tylko do analizy jakościowej, a wykrywanie ilościowe jest bardzo trudne, a zdolność multipleksowania i przepustowość są bardzo ograniczone, a jednocześnie można wykryć tylko jeden wystarczający kwas nukleinowy [96,110,127].
Chociaż większość zastosowań LFA koncentruje się na testach immunologicznych, zastosowanie LFA do diagnostyki molekularnej w chipach mikroprzepływowych jest również skuteczne i popularne [136].W przypadku wirusa zapalenia wątroby typu B, HIV i SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] zaproponowali platformę nanocząstek LFA do konwersji w górę i wykazali wszechstronność tej zminiaturyzowanej i przenośnej platformy poprzez czułe i ilościowe wykrywanie wielu celów, takich jak kwas nukleinowy HBV.Ponadto Fu i in.[138] zademonstrowali nową LFA opartą na wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana do ilościowej analizy DNA HIV-1 w niskich stężeniach.Do szybkiego i czułego wykrywania SARS-CoV-2, Liu et al.[85] opracowali zintegrowaną mikroprzepływowo analizę przepływu bocznego RPA, łącząc RT-RPA i uniwersalny system detekcji przepływu bocznego w jeden układ mikroprzepływowy.
Zastosowanie różnych platform mikroprzepływowych różni się w zależności od konkretnych badań, w pełni wykorzystując możliwości i zalety platform.Dzięki przystępnym cenowo zaworom, pompom i kanałom LOCC jest najbardziej wszechstronną platformą różnorodności zastosowań i interoperacyjności z największym polem rozwoju.Dlatego mamy nadzieję i zalecamy, aby najnowsze badania zostały przeprowadzone w LOCC jako pierwsza próba i aby warunki zostały zoptymalizowane.Ponadto oczekuje się, że w systemie zostaną odkryte i zastosowane bardziej wydajne i dokładniejsze metody.LOAD wyróżnia się precyzyjną kontrolą płynów z istniejących urządzeń LOCC i wykazuje wyjątkowe zalety pojedynczych napędów dzięki sile odśrodkowej bez potrzeby stosowania napędów zewnętrznych, podczas gdy równoległe odpowiedzi mogą być oddzielone i zsynchronizowane.W ten sposób w przyszłości LOAD stanie się główną platformą mikroprzepływową z mniejszą liczbą operacji ręcznych oraz bardziej dojrzałymi i zautomatyzowanymi technologiami.Platforma µPAD łączy zalety LOCC i materiałów papierowych w celu uzyskania taniej diagnostyki jednorazowego użytku.Dlatego przyszły rozwój powinien koncentrować się na wygodnych i ugruntowanych technologiach.Ponadto LFA doskonale nadaje się do wykrywania gołym okiem, co zapewnia zmniejszenie zużycia próbek i przyspieszenie wykrywania.Szczegółowe porównanie platform przedstawiono w tabeli 2.
Analizy cyfrowe dzielą próbkę na wiele mikroreaktorów, z których każdy zawiera dyskretną liczbę cząsteczek docelowych [139, 140].Testy cyfrowe oferują znaczące korzyści w zakresie wykonywania bezwzględnych oznaczeń ilościowych poprzez jednoczesne i indywidualne przeprowadzanie tysięcy równoległych eksperymentów biochemicznych w przedziałach w skali mikronowej, a nie w fazie ciągłej.W porównaniu z tradycyjną mikrofluidyką reakcje w komorze mogą zmniejszać objętość próbki, zwiększać wydajność reakcji i być łatwo integrowane z innymi metodami analitycznymi bez potrzeby stosowania kanałów, pomp, zaworów i kompaktowych konstrukcji [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Następujące dwie metody są stosowane w testach cyfrowych w celu uzyskania równomiernego i dokładnego rozdziału roztworów, w tym odczynników i próbek, takich jak komórki, kwasy nukleinowe i inne cząstki lub cząsteczki: (1) emulsje kroplowe wykorzystujące niestabilność międzyfazowej cieczy;(2) podział szyku jest realizowany przez ograniczenia geometryczne urządzenia.W pierwszej metodzie kropelki zawierające odczynniki i próbki w mikrokanałach można tworzyć metodami pasywnymi, takimi jak współprąd, przepływ krzyżowy, ogniskowanie przepływu, emulsyfikacja etapowa, emulsyfikacja mikrokanałowa i membrany poprzez lepkie siły ścinające i emulsyfikację ze zmianą kanału.lokalizacji [143, 145, 146, 148, 149] lub z wykorzystaniem metod aktywnych [150, 151], które wprowadzają dodatkową energię poprzez sterowanie elektryczne, magnetyczne, termiczne i mechaniczne.W tym drugim podejściu najlepszą jednorodność objętości płynu w komorach mikroprzepływowych dzieli się przy zachowaniu struktur przestrzennych o tej samej wielkości, takich jak mikrowgłębienia i matryce powierzchniowe [152,153,154].Warto zauważyć, że kropelki są głównymi odcinkami przepływu, które można również generować i manipulować na matrycach elektrod opartych na cyfrowej mikroprzepływie (DMF).Elektrozwilżanie dielektryków jest jedną z najlepiej zbadanych teorii DMF, ponieważ elektrozwilżanie dielektryków pozwala na precyzyjną manipulację poszczególnymi kroplami, kontrolowanie kształtu cieczy i asymetrycznych sygnałów elektrycznych przechodzących przez różne strony [141, 144].Główne operacje z kropelkami w DMF to sortowanie, rozdzielanie i łączenie [151, 155, 156], które mogą znaleźć zastosowanie w różnych dziedzinach analizy, zwłaszcza w detekcji molekularnej [157, 158, 159].
Cyfrowa detekcja kwasów nukleinowych to technologia diagnostyki molekularnej trzeciej generacji, oparta na konwencjonalnej reakcji PCR i ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), równolegle z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem i biopsją płynną.W ostatnich dwóch dekadach cyfrowe kwasy nukleinowe szybko rozwinęły się w dziedzinie diagnostyki molekularnej patogenów zakaźnych [160, 161, 162].Bezwzględna kwantyfikacja cyfrowego wykrywania kwasów nukleinowych rozpoczyna się od pakowania próbek i odczynników do poszczególnych przedziałów, aby zapewnić, że każda sekwencja docelowa ma takie samo prawdopodobieństwo dostania się do każdego indywidualnego przedziału.Teoretycznie każdej sekcji można przypisać wiele sekwencji docelowych lub może nie istnieć niezależny system mikroreakcji.Dzięki różnym mechanizmom wykrywania opisanym powyżej, przedziały z sekwencjami docelowymi drobnoustrojów, które generują sygnały powyżej pewnego progu, mogą być wizualizowane gołym okiem lub przez maszynę i są oznaczone jako pozytywne, podczas gdy inne przedziały, które generują sygnały poniżej progu, są oznaczone jako pozytywne .ujemne, które sprawiają, że sygnał dla każdej sekcji ma wartość logiczną.W ten sposób, obliczając liczbę utworzonych kompartmentów i wskaźnik pozytywnych wyników po reakcji, oryginalne kopie próbek testowych można dopasować za pomocą wzoru na rozkład Poissona bez potrzeby tworzenia krzywej standardowej, która jest wymagana w rutynowych analizach ilościowych, takich jak: jako qPCR.[163] W porównaniu z tradycyjnymi metodami diagnostyki molekularnej, cyfrowe wykrywanie kwasów nukleinowych charakteryzuje się wyższym stopniem automatyzacji, wyższą szybkością i czułością analizy, mniejszą liczbą odczynników, mniejszym zanieczyszczeniem oraz prostszym projektem i produkcją.Z tych powodów zastosowanie testów cyfrowych, zwłaszcza metod kroplowych, w diagnostyce molekularnej, łączących techniki amplifikacji i odczytu sygnału, zostało dobrze zbadane podczas krytycznej epidemii SARS-CoV-2.Na przykład Yin i in.[164] połączyły metody cyfrowe kropelkowe i szybkie PCR do wykrywania genów ORF1ab, N i RNazy P w SARS-CoV-2 na chipie mikroprzepływowym.Warto zauważyć, że system był w stanie zidentyfikować pozytywny sygnał w ciągu 115 sekund, co jest szybsze niż konwencjonalny PCR, co wskazuje na jego skuteczność w wykrywaniu w miejscu opieki (Rysunek 7a).Dong i in.[165], Sow i in.[157], Chen i in.[166] oraz Alteri i in.[167] zastosowali również cyfrowy PCR kropelkowy (ddPCR) do wykrywania SARS-CoV-2 w układzie mikroprzepływowym z imponującymi wynikami.Aby jeszcze bardziej poprawić wskaźnik wykrywalności, Shen i in.[168] osiągnęli obrazowanie chipów oparte na ddPCR w zaledwie 15 s bez użycia technik łączenia obrazów, przyspieszając proces technologii ddPCR od laboratorium do aplikacji.Stosowane są nie tylko metody amplifikacji termicznej, takie jak PCR, ale również metody amplifikacji izotermicznej są stosowane w celu uproszczenia warunków reakcji i szybkiej odpowiedzi.Lu i in.[71] opracowali SlipChip do analizy kropelek, zdolny do generowania kropelek o różnych rozmiarach o dużej gęstości w jednym kroku i ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych SARS-CoV-2 przy użyciu cyfrowej LAMP (Rysunek 7b).Jako szybko rozwijająca się technologia, CRISPR może również odgrywać ważną rolę w cyfrowym wykrywaniu kwasów nukleinowych dzięki wygodnemu obrazowaniu kolorymetrycznemu bez konieczności stosowania dodatkowych barwników kwasów nukleinowych.Ackerman i in.opracowali kombinatoryczną reakcję matrycową do multipleksowej oceny kwasów nukleinowych.[158] wykryli 169 wirusów związanych z człowiekiem, w tym SARS-CoV-2, w kropelkach zawierających odczynniki do wykrywania kwasu nukleinowego opartego na CRISPR-Cas13 w teście mikrostudzienkowym (Figura 7c).Ponadto w tym samym systemie można zastosować amplifikację izotermiczną i technologię CRISPR, aby połączyć zalety obu.Park i in.[169] Cyfrowy test CRISPR/Cas12a został opracowany w komercyjnym chipie mikroprzepływowym do wykrywania wyekstrahowanego i zabitego ciepłem SARS-CoV-2 w oparciu o jednoetapowy RT-RPA z krótszym i wyższym wykrywaniem sygnału do tła stosunek czasu., szerszy zakres dynamiki i lepsza czułość (rys. 7d).Niektóre opisy tych przykładów podano w Tabeli 3.
Typowa platforma cyfrowa do wykrywania kwasów nukleinowych.a Przepływ pracy szybkiej cyfrowej PCR składa się z czterech kluczowych etapów: przygotowania próbki, dystrybucji mieszaniny reakcyjnej, procesu amplifikacji i ilościowej oceny docelowej (na podstawie [164]).b Schemat przedstawiający analizę kropel SlipChip pod kątem tworzenia kropel przy dużej gęstości (na podstawie [71]).c Schemat przepływu pracy CARMEN-Cas13 (na podstawie [158]).d Przegląd zaawansowanego cyfrowego wykrywania wirusów za pomocą CRISPR/Cas w jednej puli (na podstawie [169]).W/O woda w oleju, polidimetylosiloksan PDMS, reakcja łańcuchowa polimerazy PCR, zbieranie danych DAQ, proporcjonalna całkowa pochodna PID, kombinatoryczna reakcja macierzy CARMEN do oceny multipleksów kwasów nukleinowych, SARS-CoV-2, ciężki ostry zespół oddechowy, koronawirus 2 , RT Amplifikacja polimerazy rekombinazy odwrotnej transkryptazy-RPA, sygnał S/B w tle
Czas publikacji: 15 września-2022
